新型硅酸镁(1∶6)用于几种蔬菜中4-壬基酚净化效果研究

颜 旭,关舒会,饶钦雄,张其才,陈珊珊,宋卫国*

(1 上海海洋大学食品学院,上海 201306;2 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 201403)

壬基酚(Nonylphenol,NP)作为一种有毒的异生化合物,常被用作精细化工中间体,是壬基酚聚氧乙烯醚(Nonylphenol ethoxylates,NPEOs)的主要合成物和降解产物,还被用作制造清洁剂、农药助剂、树脂稳定剂、润滑油添加剂等[1-2]。 作为典型的内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)之一,NP 具有类雌激素活性和生物毒性[3]。 蔬菜可能是对人类有害的NP 的潜在来源。 根据任杰等[4]的研究,分析了从海口市随机抽取的5 种蔬菜,发现均有4-NP 检出,白菜和油菜的检出率为100%,含量为1.26—8.58 μg∕kg。 张涛等[5]抽取了长沙市61 种市售蔬菜,检测了4 种类雌激素含量,结果显示壬基酚的检出率最高,含量为4.92—90.96 ng∕g。 在蔬菜中已有NP 检出,严重影响食品安全及消费者健康。 因而,开发准确、灵敏的食品中NP 检测方法具有现实意义。

蔬菜中壬基酚的含量分析常采用固相萃取(Solid phase extraction,SPE)方法净化,液相色谱(HPLC)或高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用测定[6]。 闫冬良等[7]建立了SPE-HPLC 方法,测定芹菜中4-壬基酚在内的6 种环境雌激素,检出限为3.7—6.3 μg∕L,平均加标回收率在89.60%—97.13%。 She 等[8]通过石墨化炭黑串联N-丙基乙二胺(PSA) 管固相萃取净化,结合液相色谱-串联四极杆质谱法(HPLC-MS∕MS)测定了蔬菜中4-NP 在内的NPEOs 及其残留物含量,添加回收率为65%—118%,相对标准偏差为1.1%—6.2%。 实际样品检测中,为了降低基质效应,提高测定准确性,减少对仪器损害,样品前处理显得至关重要[1,9]。 PSA 作为前处理中应用广泛的吸附材料,但不能被回收利用[10]。 相对成熟的新型吸附材料如碳纳米管[11]、石墨烯[12]具有优异的吸附性能,也被用于样品的前处理净化。 此外硅酸盐类吸附剂来源广泛、价格低廉[13]。 赵洁等[14]利用球磨法制备了多孔的硅酸镁吸附材料,对水中亚甲基蓝的最大吸附量为280 mg∕g。 通过一步水热法引入硅酸钠、和镁盐对天然凹凸棒进行改性,对Cu2+和亚甲基蓝的最大吸附量分别为527.22 mg∕g 和210.64 mg∕g[15]。 Navickiene 等[16]评估了硅酸镁在分散固相萃取净化,结合GC-MS∕MS 联合测定啤酒中的15 种农药残留的应用,结果表明硅酸镁是一种有效的替代净化材料,方法具有准确性、可靠性的同时降低了成本。 硅酸盐类吸附剂在废水中染料、重金属吸附,前处理领域已被证实具有良好的性能,但是对壬基酚的应用研究还未见报道。

本研究通过溶胶-凝胶法制备具有良好吸附性能、更具经济效益的新型硅酸镁(MS-1∶6)作为固相萃取填料,优化洗脱液和洗脱体积,考察重复利用性和对蔬菜中壬基酚的净化效果,以期建立一种更具经济效益的蔬菜中4-NP 检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪(美国Waters 公司);AB 5500 型三重四极杆质谱仪(美国ABSCIEX 公司);MX-S 涡旋仪(美国赛洛捷克公司);万分之一电子分析天平(上海Ohaus 公司);NEVAP-12 氮吹仪(美国Organomation 公司);CQ-250-DST 超声波清洗器(上海跃进医用光学器械厂);D-37520 低温高速离心机(美国Thermo 公司);蔬菜粉碎机(中山市欧麦斯电器有限公司);Ultra 系列超纯水(上海首立实业有限公司);GM-0.1A 负压抽滤装置(天津市津腾实验设备有限公司)。

4-壬基酚(99%)、硝酸(AR)购自上海麦克林生化科技有限公司;氨水、乙腈、丙酮、正己烷、甲醇(HPLC 级,德国Merck 公司);氯化钠(AR,上海爱彼化学试剂有限公司);九水硅酸钠(GR)、氯化镁(99%)、氢氧化钠(96%)、盐酸(AR)购自国药集团化学试剂有限公司;多层氧化石墨烯(GO 98%,上海源叶生物科技有限公司);氨基化多壁碳纳米管(AMNCTs 95%,上海阿拉丁试剂有限公司);N-丙基乙二胺(PSA 40 μm,上海安捷伦科技有限公司)。 试验用水均为超纯水。

1.2 4-NP 标准曲线和添加样品制备

标准储备溶液(5 000 mg∕L):准确称量0.50 g 4-NP 溶于50 mL 的棕色容量瓶,用甲醇充分溶解并定容。

标准中间溶液(50 mg∕L):用甲醇稀释4-NP 标准储备溶液。

标准使用液(10 mg∕L):取标准储备液0.1 mL 于50 mL 的棕色容量瓶,超纯水定容,充分混匀。

溶剂标准曲线和基质标准曲线:分别用乙腈和蔬菜基质提取液将4-NP 稀释成0.01 mg∕L、0.05 mg∕L、0.1 mg∕L、0.25 mg∕L、0.5 mg∕L 的不同浓度的标准工作溶液。

标准储备溶液于-18 ℃冰箱中储存,保质期6 个月,其余溶液4 ℃冰箱中储存,保质期3 个月。 配制标准使用液和标准工作溶液时保证甲醇处于较低含量( ＜2‰),以避免共溶剂效应。

考虑到不同蔬菜基质中的干扰物成分不同对残留分析的影响,选取5 种具有代表性的蔬菜:白菜(十字花科植物)、四季豆(豆科植物)、生菜(菊科植物)、黄瓜(葫芦科植物)、洋葱(百合科植物),购自当地农贸市场,并进行空白样品4-NP 含量测定。 5 种蔬菜中加入适量中间浓度标准溶液,添加水平为10 μg∕kg、50 μg∕kg、100 μg∕kg,每组5 个重复。

1.3 吸附材料

1.3.1 溶胶-凝胶法制备硅酸镁

硅酸镁现用现制,具体方法为:在水浴持续搅拌下,通过向0.5 mol∕L 九水硅酸钠溶液中相同浓度的氯化镁溶液,控制镁∕硅比例为1∶6。 混匀之后,用盐酸和氢氧化钠调节pH,在水浴条件下继续搅拌2 h,放置陈化12 h,倾出上层溶液,用去离子水洗涤,去除杂质和氯离子,烘箱60 ℃烘干,研磨,编号MS-1∶6,待用。

1.3.2 吸附性能考察

在25 ℃、35 ℃、45 ℃条件下,准确称取6 mg 的吸附材料,分别置于一组含有30 mL(10 mg∕L)4-NP 溶液的琥珀色玻璃瓶中,恒温气浴振荡,间隔相应时间取样(0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、240 min、300 min),使用0.22 μm 的滤膜分离吸附剂和吸附质。 利用超高效液相色谱质谱联用仪测定吸附质浓度,所有试验平行进行3 次,每个试验数据由平均值获得。 按照公式计算吸附量:

其中,qt(mg∕g)是t时每单位量吸附剂吸附的4-NP 的量,C0是4-NP 的初始浓度,Ce是t时4-NP 溶液的浓度,V是4-NP 溶液体积,m是吸附剂的投加量。

1.4 分析方法

1.4.1 样品的提取与净化

提取方法参考张其才等[17],将蔬菜匀浆后,准确称取5.00 g(精确到0.01 g)于50 mL 塑料离心管中,加入20 mL 乙腈,涡旋提取2 min,超声提取10 min,加入氯化钠5 g,振荡1 min,于8 000 r∕min 下离心5 min;取上清液5 mL 于试管中,待净化。

分别称取200 mg 的MS-1∶6、GO、AMCNTs、PSA 均匀装填入商品SPE 柱管(3 mL),自上而下分别是垫片、吸附剂、垫片。 5 mL 乙腈,5 mL 超纯水负压预淋洗SPE 柱。 将待净化溶液上样到SPE 柱,固相萃取仪负压下以1 mL∕min 的流速通过SPE 柱,接收上样液,另加入5 mL 乙腈洗脱,氮气吹干,加入1 mL 乙腈复溶,过0.22 μm 有机滤膜转移至进样小瓶中,外标法定量测定。

1.4.2 仪器条件

色谱柱:Waters BEH C18 色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速0.35 mL∕min,流动相A 相为甲醇,B 相为0.1%氨水。 梯度洗脱程序:0—2.0 min,30% A,70% B;2.0—5.5 min 95% A;5.5—6.0 min,30%A,70% B。 进用量2 mL,柱温40 ℃。

质谱条件:采用电喷雾负离子源扫描(ESI -);多反应监测模式(MRM);离子化电压5 kV;温度500 ℃;喷雾气55 μL∕min;气帘气35 μL∕min;4-NP 母离子为219.3 m∕z,定性离子对为133.0∕147 m∕z,定量离子为133.0 m∕z,碰撞能量为-38 eV∕-37 eV。

1.4.3 方法确定

主要包括:基质效应、线性、检出限、定量限及方法的准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 合成硅酸镁的吸附性能

为了考察MS-1∶6对4-NP 的吸附性能,建立吸附量(mg∕g)与时间的关系曲线,在25 ℃、35 ℃、45 ℃3 个温度下进行。 如图1 所示,MS-1∶6表现出优异的吸附性能,25 ℃下对4-NP 的最大吸附量为30.84 mg∕g。 随着温度的升高,4-NP 的吸附量逐渐降低,表明在较低温度下有利于MS-1∶6对4-NP 的吸附,可以满足常温条件下对样品的SPE 净化要求。

图1 温度对4-NP 吸附量的影响Fig.1 Effect of temperature on adsorption of 4-NP

2.2 合成硅酸镁SPE 柱净化方法的优化

为了得到最佳净化结果,得到合适的洗脱溶剂。 以50 μg∕kg 乙腈溶液上样,比较了10 mL 甲醇、乙腈、丙酮和正己烷∶丙酮(1 ∶9)4 种不同极性的有机溶剂洗脱效果,结果见图2A,乙腈的平均回收率(103%)高于甲醇(76%)、丙酮(51.5%)和正己烷∶丙酮(1∶9)(42.6%)。 在此基础上,选择乙腈作为活化-洗脱溶剂。

图2 洗脱溶剂(A)和用量(B)对4-NP 回收率的影响Fig.2 Effect of types of eluent(A) and volume of eluent(B) on the recovery of 4-NP

在50 μg∕kg 添加浓度下,比较了2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL 乙腈用量对4-NP 洗脱回收率的影响。 结果见图2B,在洗脱液为2 mL 时,平均回收率为60%,洗脱液为5 mL 时,对4-NP 的回收率接近100%。 继续增大洗脱液体积后,回收率也趋于稳定。 从经济效果和减少氮吹时间的方面考虑,选取5 mL的乙腈用量进行洗脱。

2.3 多种材料净化效果的比较

作为净化中常用的吸附材料,PSA 主要吸附方式为静电吸附,氨基是主要吸附功能基[18];GO 具有高比表面积,丰富的表面含氧基团等特点,具有较好的吸附性能[19]。 净化材料不同,净化程度的强弱不同,从而影响回收率[20]。 因此,在上述优化后的洗脱条件下,采用固相萃取作为前处理净化方法,研究了MS-1∶6与现有商业吸附材料、N-丙基乙二胺(PSA)对4-NP 的基质效应的影响。 选用白菜作为代表基质,在50 μg∕kg 添加浓度下,对5 mL 乙腈提取液进行净化,结果见图3A,经过SPE 净化后的平均回收率为GO(102.52%) ＞MS-1∶6(87.20%) ＞AMCNTs(85.10%) ＞PSA(79.60%)。 相比于其他材料,MS-1∶6在价格上更具明显优势[PSA 56 元(人民币,下同)∕g,GO 300 元∕g,AMCNTs 119.8 元∕g,MS-1∶6 0.2 元∕g]。 因此,新型MS-1∶6作为固相萃取柱填料进行样品4-NP 净化,经济可行,但需要进一步方法学考察。

图3 4 种吸附材料净化后4-NP 的基质效应(A)固相萃取小柱的循环使用(B)Fig.3 Matrix effect of 4-NP purified by four adsorption materials(A) and recycle of SPE cartridge(B)

2.4 固相萃取小柱循环使用

固相萃取柱的循环使用性是衡量材料应用的重要指标之一,选用白菜作为代表基质,在50 μg∕kg 的4-NP 添加浓度下,进行重复吸附-解析循环6 次,考察所填充的小柱的可重复使用性能。 在最优的条件下进行吸附-洗脱,一个循环结束后,将小柱放于氮气流下吹干,以减少试验误差。 如图3B 所示,在经过6 次的重复使用后,回收率大于80%,在蔬菜中4-NP 的前处理中具有较好的应用前景。

2.5 方法学考察

2.5.1 基质效应、线性、检出限与定量限

通过溶剂标准曲线斜率(msolvent)和基质标准曲线斜率(mmatrix)来计算基质效应(Matrix effect,ME)。ME=mmartix∕msolvent,基质效应为0.8—1.2 时可接受[17,21]。 本试验评估3 种蔬菜的基质效应,结果见表1。3 种蔬菜都表现出基质减弱效应,基质效应均小于0.8,因此本研究采用的是基质标准工作溶液进行外标法定量。 在10—500 μg∕L 范围内,质量浓度与峰面积之间呈良好的线性关系,决定系数均不低于0.999。以3 倍信噪比(S∕N)作为4-NP 测定浓度的检出限(LOD),以10 倍信噪比(S∕N)作为4-NP 测定浓度的定量限(LOQ)。 在白菜、生菜、洋葱3 种基质中的方法检出限分别为0.6 μg∕kg、0.8 μg∕kg、0.6 μg∕kg,定量限为2 μg∕kg。

表1 3 种蔬菜中4-NP 的基质效应、线性、检出限和定量限Table 1 Matrix effect,linearity,LOD and LOQ of 4-NP in three vegetables

2.5.2 方法回收率和精密度

方法准确性与精密度用回收率和变异系数衡量。 表2 结果显示了最优条件下4-NP 在5 种蔬菜基质中的添加回收率和相对标准偏差。 在10 μg∕kg 的添加水平下,5 种蔬菜中4-NP 回收率为84.13%—103.42%,相对标准偏差(RSD)为3.54%—7.81%;在50 μg∕kg 的添加水平下,5 种蔬菜中4-NP 回收率为85.64%—106.56 %,相对标准偏差(RSD)为4.41%—10.86 %;在100 μg∕kg 的添加水平下,5 种蔬菜中4-NP 回收率为94.36%—102.27%,相对标准偏差(RSD)为1.5%—7.13%。 综上所述,4-NP 回收率和相对标准偏差符合食品中壬基酚测定的再现性要求。 该方法具有较好的回收率和重现性,满足复杂样品中痕量物质的分析要求,能够应用于蔬菜中NP 的测定。

表2 4-NP 在5 种蔬菜中的平均添加回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Average addition recoveries and RSDs of 4-NP added to five vegetables(n=5) %

2.6 方法比对

将本研究与近年来已报道的对食品及食品包装材料的检测方法进行比较,结果见表3。 本方法溶剂消耗量低于常规检测方法,节省了检测成本。 无需内标,无需衍生化处理,方法简单,易操作。 采用负压下SPE 净化,减少了前处理时间。 检出限与其他液相色谱串联质谱法检出限相近,低于其他检测方法,表明该方法具有较高灵敏度,可以满足蔬菜等低脂肪含量食品中的4-NP 测定。

表3 本研究与已报道的方法比较Table 3 This study compared with other reported method

3 结论与讨论

本研究合成一种硅酸镁吸附材料,采用负压SPE 净化模式,液相色谱-串联质谱法分析,建立了蔬菜中4-NP 的检测方法。 对4-NP 具有较好的吸附效果,净化效果优于传统净化材料(PSA),略高于AMCNTs,低于GO。 具有较高成本优势,为GO 的1∕1 500,AMCNTs 的1∕600,PSA 的1∕280。 5 种蔬菜中4-NP 回收率为88.63%—106.82%,RSD 为1.5%—10.86%,检出限为0.6—0.8 μg∕kg,定量限为2 μg∕kg,满足蔬菜中壬基酚的测定要求。

黄荣荣等[28]在样品中加入同位素内标后,经Carb∕NH2固相萃取柱净化,平均回收率为87.9%—98.0%。 马启明等[29]采用凝胶渗透色谱柱(GPC)净化,收集14—17 min 组分旋转蒸干,对奶粉中4-NP回收率为87.3%—96.5%,本流程较为简单,减少溶剂消耗,并且回收率较高。 本研究建立MS-1∶6固相萃取净化方法对蔬菜中4-NP 检测具有较高回收率,提高效率,并且减少溶剂的使用,方法灵敏度高,操作简单,具有广泛的应用前景。