牦牛VEGFA双荧光素酶载体构建及与miR-200b的靶向验证

谢建鹏 陈平 王斐 何振富

摘要：为探究微小RNA（miR-200b）与血管內皮生长因子A（VEGFA）基因之间的靶向关系，采用miRanda和Targetscan软件预测牦牛miR-200b与VEGFA可能存在结合位点，构建了VEGFA基因3′UTR区的野生型和突变型双荧光素酶载体。利用与目的miRNA靶种子序列相结合基因的突变序列，构建该靶基因的突变型重组质粒（pGL3-promoter-mut VEGFA），再进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验。结果表明，预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点。PCR进行扩增和测序之后，VEGFA基因3′UTR区的野生型、突变型载体构建成功。共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组（P < 0.05），VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异（P ＞ 0.05）。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性，验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。

关键词：牦牛；载体构建；双荧光素酶；VEGFA基因；miR-200b

中图分类号：S823.8               文献标志码：A              文章编号：2097-2172（2023）08-0745-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.08.012

Construction of Yak VEGFA Double Luciferase Vectors and

Their Targeting against miR-200b

XIE Jianpeng， CHEN Ping， WANG Fei， HE Zhenfu

（Institute of Animal Husbandry， Pasture and Green Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： In order to investigate the targeting relationship between miR-200b related to yak reproduction and vascular endothelial growth factor A（VEGFA） gene， miRanda and Targetscan were used to predict the possible binding site between miR-200b and VEGFA in yak. The wild-type and mutant dual-luciferase vectors of VEGFA 3′UTR region was constructed. The mutant plasmid pGL3-Promoter-mut VEGFA of the target gene was constructed by using the mutant sequence of the target gene and the target seed sequence of the target miRNA. Then the co-transfection experiment of the target miRNA mimic and the recombinant plasmid was carried out. The results showed that the predicted binding site between miR-200b and the 3′UTR region of VEGFA gene existed. After PCR amplification and sequencing， the results showed that the wild-type and mutant vectors of VEGFA 3′UTR region were successfully constructed. The double luciferase activity of co-transfected VEGFA wild-type vector and miR-200b mimic was significantly lower than that of the control group （P < 0.01）， while the double luciferase activity of co-transfected VEGFA mutant vector and miR-200b mimic was not significantly different from that of the control group（P > 0.05）. These results indicated that the  3′UTR region of VEGFA gene could bind to miR-200b and inhibit dual luciferase activity， which verified that VEGFA was a target gene of miR-200b.

Key words： Yak; Vector construction; Dual-luciferase; VEGFA gene; miR-200b

收稿日期：2022 - 10 - 09；  修訂日期：2023 - 06 - 20

基金项目：甘肃省农业科学院科研条件建设及成果转化项目（2021GAAS51）。

作者简介：谢建鹏（1990 — ），男， 甘肃会宁人，助理研究员，博士，研究方向为动物营养及繁殖。Email：18709480641@163.com。

作者简介：何振富（1985 — ），男，甘肃会宁人，副研究员，硕士，研究方向为动物营养及繁殖。Email：gshezhenfu.163.com。

RNA干扰（RNAi）其中包括miRNA mimics（即运用化学合成的方法，模拟生物体内源的miRNA，特异性增强内源型miRNA的功能）技术，是小片段RNA与目的基因mRNA的特定区域发生特异性结合，进而使得靶mRNA的降解加剧，从而出现失活现象，这一技术已广泛运用于分子生物学研究领域［1 ］。而现有方法包括qRT-PCR、GFP蛋白融合及Western Bolt等，在检测RNA干扰对相应靶基因调控的验证技术中，这些方法操作繁杂，并且对高通量选择的需要无法满足［2 - 3 ］。miRNA mimics 技术已有许多报道，如刘鸿艳等［4 ］通过双荧光素酶报告系统探究了猪E2F3基因3′UTR区与miR-10a-5p的靶向关系，表明猪E2F3基因与miR-10a-5p之间存在靶向关系；张凤等［5 ］鉴定了miR-25与肉牛DKK3 3′UTR区存在靶向关系。牦牛（Bos grunniens）主要分布在青藏高原及其毗邻高海拔地区，是当地牧民重要的生产和生活资料，但由于饲草料资源匮乏，严重制约着牦牛生产水平的提高。牦牛的生产水平与其繁殖力关系紧密，结合遗传学方法从遗传本质上提高牦牛的繁殖效率，可明显提高牦牛的生产水平。谢建鹏［6 ］的研究表明，在冷季补充混合饲料，通过提高牦牛的营养水平进而提高了其繁殖效率。通过高通量测序技术对牦牛的卵巢组织进行Small RNA测序，获取差异表达miRNA，预测差异表达miRNA靶基因，并进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，筛选牦牛通过营养水平与繁殖力相关的miRNA。实时荧光定量（qRT-PCR）验证发现，miR-200b表达显著下调，VEGFA表达上调，这与miRNA调控靶基因的特点一致，提示miRNA可能通过靶向调控基因参与牦牛的繁殖过程。我们通过miRanda和Targetscan预测VEGFA和miR-200b的结合位点，随后构建双荧光素酶载体并进行了双荧光素酶报告基因实验，以验证miR-200b对VEGFA的靶向调控作用。

1   材料与方法

1.1   供试材料

TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶，购自天根生化科技有限公司；Trans2K Plus II DNA标记，购自TaKaRa公司；限制性内切酶（Kpn I；Bgl II；XhoI），购自北京全式金生物有限公司；EasyPure快速凝胶提取试剂盒，购自凯基生物有限公司；T4 DNA连接酶，购自博士德生物有限公司；Trans1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞，购自北京全式金生物有限公司；TransCultTM LB琼脂平板，购自天根生化科技有限公司；EasyPure Hipure Plasmid MaxiPrep试剂盒，购自北京全式金生物有限公司；TransSerum EQ胎牛血清，购自文渊阁生物科技有限公司；TransDetect双荧光素酶报告基因检测试剂盒，购自北京全式金生物有限公司。

1.2   试验方法

1.2.1    miRNA的靶基因预测    利用Targetscan和miRanda靶基因软件对miR-200b的靶基因进行预测。目标靶基因的选取通过取交集确定，再结合KEGG通路筛选，进而获得较为可信的靶位点。

1.2.2    靶序列野生型pGL3-Promoter载体构建    候选靶基因cDNA的序列通过NCBI网站查找，依据miRNA与其对应靶基因的结合位点位置进行常规合成，以含有结合位点的VEGFA基因3′UTR区构建野生型载体。将以上基因合成产物和pGL3-Promoter载体进行酶切和链接，图谱信息和原理见图1。

1.2.3    突变型pGL3-Promoter载体构建    在靶序列两端设计点突变引物，引物序列见表1。利用Fast Mutagenesis System 点突变试剂盒将预测的靶基因进行缺失。PCR反应体系为20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 补至 20μL。PCR 扩增反应程序为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 31 个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。取 5 μL PCR 产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

按T4 DNA Ligase说明书将线性化质粒用T4 DNA连接酶连接，每个平板挑取3个单克隆测序。将冻存的293T细胞复苏，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行细胞培养。

1.2.4    双荧光素酶报告基因检测    按体积比1∶4将5×Cell Lysis Buffer 同ddH2O混合后备用。将细胞培养基去除，用PBS小心润洗，润洗2次之后加入100 μL 1×Cell Lysis Buffer，室温下充分裂解，时间为10 min。将细胞挂取到1.5 mL离心管中离心，取上清备用。将100 μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent加入试管中，吸取20 μL细胞裂解物加至试管，混匀，于化学发光仪中检测，观察萤火虫荧光素酶报告基因的活性。之后吸取100 μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent II，加入上述反应管中，在化学发光仪中检测，观察海肾荧光素酶报告基因的活性。

2   结果与分析

2.1    bta-miR-200b的靶基因预测

选择在前期试验已知差异表达的miR-200b为研究对象，通过软件共同预测及分析查找，获得较为可信的靶位点。VEGFA基因为miR-200b的候选靶基因，其结合位点如图2所示。

2.2   野生型pGL3-Promoter载体构建

常规合成含有结合位点的VEGFA基因3′UTR区，进行野生型载体构建。靶基因VEGFA3′UTR区在合成序列两端分别引入5'（Kpn I）和3'（BglII）酶切位点，将基因通过5′KpnI 、3′BglII克隆至载体pGL3-promoter（Ampicillin），制备maxi-scale （Endo-free）重组质粒DNA和含有该重组质粒的穿刺菌。合成VEGFA基因载体构建的序列具体见图3。合成VEGFA基因3′UTR区序列总长度为1 011个碱基，GC含量为48.17%（图4）。

2.3   突变型pGL3-Promoter载体构建与鉴定

2.3.1    靶基因缺失PCR结果利用Fast Mutagenesis System 点突变试剂盒将预测的靶基因进行缺失，取10μL PCR产物进行1%TAE琼脂糖凝胶电泳检测点突扩增。结果显示，缺失突变产物成功扩增，且条带较亮，经DMT酶消化后可用于后续实验。靶基因缺失PCR结果见图5。

2.3.2    单克隆测序结果    每个平板挑取3个单克隆进行测序，测序结果如图6所示，结果表明，挑取的6个单克隆均成功缺失对应的靶基因。

2.4   不同靶序列与miRNA作用验证结果

利用miR-200b mimics与野生型重组载体（pGL3-promoter-wtVEGFA），对293T细胞进行共转染，对海肾荧光素酶的活性变化进行统计。利用与目的miRNA靶种子序列结合的基因的突变序列，构建该靶基因的突变型重组质粒（pGL3- promoter-mutVEGFA），进行重组质粒和目的miRNA的miRNA mimic的共转染实验，结果见图7。miR-200b mimics分别与pGL3-promoter-wt/mut VEGFA-3′UTR共转染时，pGL3-promoter-wt VEGFA- 3′UTR+miR-200b mimics组荧光素酶活性显著低于pGL3-promoter-wtVEGFA-3′UTR+mimicsNC组（P < 0.01），pGL3-promoter-mutVEGFA-3′UTR+ miR-200b mimics组与对照组pGL3-promoter-mut VEGFA-3′UTR+mimicsNC荧光素酶活性无显著差异（P > 0.05）；miR-200b mimics+pGL3-promoter组与mimicsNC+pGL3-promoter组荧光素酶活性差异不显著（P > 0.05）。表明miR-200b具有靶向结合VEGFA 3′UTR并调控其表达的功能。

3   讨论与结论

本试验前期在非繁殖季节探究了补饲对牦牛卵巢miRNA表达谱的影响，发现了51个差异表达的miRNA，基于qRT-PCR，对差异表达的miR- 200b进行了预测并鉴定了其靶基因VEGFA［7 ］。本试验通过双荧光素酶报告系统验证了miR-200b和靶基因VEGFA的靶向关系，从繁殖层面探索了miRNA和靶基因相互作用的关系。有研究表明，miR-200b可以负向靶向VEGFA。Liu等［8 ］報道，在3′-UTRs中选择了种子序列保守的mRNAs用于肿瘤和正常肾脏间差异表达的miR，并鉴定了表达与miR呈负相关的靶mRNA，发现miR-200家族和VEGF之间存在明显的负相关。藏小晴等［9 ］研究了正常肝细胞和肝癌细胞miR-200b-3p与VEGFA mRNA的表达，双荧光素酶报告检测靶向关系，结果表明miR-200b-3p直接靶向负调控VEGFA。以上研究揭示，miR-200b靶向调控VEGFA与肿瘤相关，通过查阅相关文献发现，VEGFA对家畜繁殖也存在关联。

相关研究表明，VEGF家族由VEGFA、PLGF、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE等6个成员组成，其中VEGFA对血管内皮细胞增殖和分化的影响最大。VEGFs在早期卵泡发育过程中，表达量相对较低，随着卵泡不断地成熟，它在颗粒层和膜层的含量将会显著增加［10 ］。在卵泡选择中，FSH和随后LH诱导的颗粒细胞层内的VEGF产生增强了卵泡膜层内的血管生成，进而增强黄卵黄的掺入促进了排卵前卵泡的快速生长［11 ］。由于卵泡发育的特殊性，VEGF主要通过促血管生成作用从而促进卵泡中血管网的形成，而血管网的形成为供应促性腺激素、生长因子、类固醇激素前体等营养物质提供了保证，最终VEGF通过旁分泌与自分泌等形式周期性地促进卵巢中血管生长与形成，调节卵巢的血流，从而调节了卵泡的生长［12 ］。

本研究预测到的miR-200b与VEGFA基因的3′UTR区存在结合位点，miR-200b mimics分别与pGL3-promoter-wt/mutVEGFA-3′UTR共转染VEGFA野生型载体和miR-200b mimic的双荧光素酶活性极显著低于对照组（P ＜ 0.01），VEGFA突变型载体和miR-200b mimic共转染的双荧光素酶活性与对照组无显著差异（P ＞ 0.05）。说明VEGFA基因的3′UTR区能与miR-200b结合并抑制双荧光素酶活性，验证了VEGFA是miR-200b的靶基因。

參考文献：

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