绿刺蛾属和黄刺蛾属线粒体基因组研究进展

闫久阳 靳瑞欣 周云威 张秀英

摘要 鳞翅目刺蛾科绿刺蛾属和黄刺蛾属幼虫俗称“洋辣子”，它们常危害果树、绿化树木、农作物等，在我国已被报道有危害现象的共有9种。线粒体基因组的测序为害虫防治工作奠定了基础。综述褐边绿刺蛾和黄刺蛾的线粒体基因组的提取和分析的方法，并对两者的线粒体基因组的结构特征、蛋白质编码基因、tRNA基因、rRNA基因、非编码区（控制区和基因间隔区）、基因重叠区以及基因重排现象进行了概述，同时总结了这2个属的线粒体基因组的测序进展，并对未来的测序工作提出了一些展望。

关键词 绿刺蛾属；黄刺蛾属；线粒体基因组

中图分类号：Q812 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2023）07–0001-04

绿刺蛾属Parasa和黄刺蛾属Cnido-campa，两者均隶属于动物界Animalia、节肢动物门Arthropoda、昆虫纲Insecta、鳞翅目Lepidoptera、刺蛾科Limacodidae，其中，绿刺蛾属世界已知253种[1-2]，我国已记载46种[3]；黄刺蛾属世界已知7种，我国已记载4种[4]。

绿刺蛾属和黄刺蛾属昆虫对大量果树和绿化植被造成严重危害，其中我国已报道中国绿刺蛾Parasa sinica（Moore）、丽绿刺蛾Parasa lepida （Cramer）、褐边绿刺蛾Parasa consocia （Walker）、双齿绿刺蛾Parasa hilarata （Staudinger）、两色绿刺蛾Parasa bicolor （Walker）、迹斑绿刺蛾Parasa pastoralis （Butler）、水稻绿刺蛾Parasa oryzae Cai、漫绿刺蛾Parasa ostia （Swinhoe）、黄刺蛾Cnidocampa flavescens （Walker）[5–13]对果树、绿化树木、农作物等的危害较为严重；二者的低龄幼虫常聚集分布在叶片的背面，取食叶肉保留叶脉，随着幼虫的成长渐渐开始分散取食，可将叶片全部吃光或只保留叶柄，严重影响树木生长，造成减产。

线粒体是大多数真核生物的能量生产车间，是有氧呼吸的主要场所，具有双层膜结构，是半自主细胞器。近年来，随着基因测序的不断发展和完善，少数的绿刺蛾属和黄刺蛾属的线粒体全基因组被测定。据Genbank数据库统计，绿刺蛾属有一种（褐边绿刺蛾Parasa consocia （Walker））线粒体基因组被提交（Sun 2019报道Parasa tessellata的线粒体基因组），但在Genbank显示未被证实[14]其线粒体基因组的完整序列，因此此处不对其进行综述。黄刺蛾属有一种（黄刺蛾Monema flavescens Walker）线粒体基因组被提交。

本篇综述了2种刺蛾（褐边绿刺蛾的登录号为KX108765，黄刺蛾的登录号为NC_032683）线粒体基因组的提取和分析方法、基因结构特征、蛋白质编码基因、tRNA基因、rRNA基因、非编码区（控制区和基因间隔区）、基因重叠区以及基因重排现象，分析绿刺蛾属和黄刺蛾属线粒体基因组独特的线粒体基因特征，为进一步了解绿刺蛾属和黄刺蛾属的分子进化、系统发育研究提供更多的证据，从而为2种刺蛾属害虫的防治工作奠定基础。

1 测序方法

PCR扩增和测序：根据其他的鳞翅目昆虫线粒体基因组序列设计的引物集[15-16]（表1）扩增整个线粒体基因组。PCR的基本条件：94 ℃下3 min，94 ℃下30 s进行35个循环，52～60 ℃下1～3 min，72 ℃下10 min。扩增过程在Mastercycler梯度下进行，反应体积为50μL。PCR扩增后由琼脂糖凝胶电泳（1%，w/v）分离，并用DNA凝胶提取试剂盒进行纯化，纯化后的PCR产物连接到T载体，测序至少3次。

序列拼接、注释与分析：序列注释使用NCBI BLAST和DNAStar packag（DNAStar Inc. Madison， WI， USA）软件进行。使用tRNAscan-SE程序对tRNA基因进行识别、验证[19]。使用Clustal X对各种鳞翅目线粒体基因组的PCGs进行比对[20]。偏度计算公式如下：AT skew = （A-T）/（A+T）；GC skew = （G-C）/（G+C），密码子使用MEGA 6.03软件进行计算。使用Tandem Repeats Finder程序预测A+T富集区的串联重复序列（Tandem repeats）[21]。

2 褐边绿刺蛾和黄刺蛾线粒体基因组的比较

2.1 线粒体基因组的结构特点

大多数真核生物细胞线粒体基因组大小一般为15～20 kb[22]，而鳞翅目线粒体基因组大小一般在15～16 kb之间，由37个基因组成的共价闭合环状双链DNA分子，结构较为简单，包括13个蛋白质编码基因（PCGs）、22个转运RNA基因（tRNA）以及2个核糖体RNA基因（rRNA） （12S rRNA和16S rRNA）。除此之外，还含有一段非编码区（CR）[23]。

目前，已测定的褐边绿刺蛾和黄刺蛾的线粒体基因组大小分别为15 296 bp和15 396 bp，两者的基因组成均符合鳞翅目基因结构的特点。同时，在37个线粒体基因中，均为23个基因由J链（The majority strand）编码，14个基因由N链（The opposite strand）编码[24]。

2.2 PCGs基因

PCGs是控制蛋白质合成的基因，鳞翅目昆虫的PCGs通常编码4类蛋白质亚基：1个细胞色素b（Cyt b）基因、3个细胞色素氧化酶亚基基因（COⅠ、COⅡ和COⅢ）、7个NADH脱氢酶亚基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5和ND6）和2个ATP酶的亚基基因（ATP6、ATP8）。黄刺蛾的PCGs区密码子总数为3 716个，其中，CUC、GUC、CCG、UGG、CGG和AGG不表达；最常见的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸，13个PCGs的AT含量为78.7%，AT偏向略正，GC偏向略负。大多数鳞翅目的PCGs都以ATN为标准的起始密码子，仅个别种的COⅠ起始密码子不固定或以四联体密码子（ATAA、ATTA、TTAG、GTAA、TTAA）和六联体密码子（TTTTAG、TATTAG、ATTTAA、ATTACG、TATCTA、TAGCGA）作为起始密码子。褐边绿刺蛾和黄刺蛾线粒体基因组中除了cox1基因以CGA作为起始密码子，其余12个PCGs均以标准的ATN作为起始密码子，并且以CGA为cox1的起始密码子在其他节肢动物线粒体基因中也很常见。鳞翅目的PCGs终止密码子一般为TAA或TAG，也有一些物种以不完整的密码子T或TA為终止密码子[25]，但不完整终止密码子转录后经多聚苷酸化加工补全可形成完整的终止密码子[26]。黄刺蛾的线粒体编码基因中有7个PCGs以标准的TAA为终止密码子，此外，nad4L基因以A为终止密码子，cox1、cox2、nad2、nad4和cob基因以不完整的密码子T作为终止密码子。

2.3 tRNA基因和rRNA基因特征

tRNA是负责携带特定的氨基酸并将其转运至氨基酸多肽链上的RNA，其能够识别特定的密码子。鳞翅目线粒体基因组中，tRNA基因一般為22个，其中14个tRNA基因是在J链被编码的，其余8个均在N链被编码，长度通常为60～75 bp。大多数后生动物中，除tRNA Ser（AGN）基因形成二级结构时缺少二氢尿嘧啶臂（D臂）无法形成典型的完整三叶草结构，其余所有tRNA均可形成典型的完整三叶草结构[27]。在褐边绿刺蛾和黄刺蛾的线粒体基因组中，tRNA的特点与大多数鳞翅目昆虫相符合。黄刺蛾线粒体基因组的22个tRNA长度为1 513 bp，每个tRNA大小在63～73 bp之间，其中A+T含量为82.4%，tRNA的AT偏向略正，GC略负。

rRNA是核糖体的组成部分，是细胞内含量最多的一种RNA，它可将氨基酸合成肽链，与蛋白质的合成有关，是较为重要的RNA。大多真核生物的rRNA为18S rRNA，而鳞翅目的rRNA则为12S rRNA（rrnS）和16S rRNA（rrnL）。在线粒体基因组中，rRNA是进化速度最慢，并且二级结构核心区域具有高度保守性的基因[28]。rRNA基因碱基的组成中含有大量的A+T，在多数种中，其A+T的含量多于PCGs中A+T的含量。黄刺蛾线粒体基因组中在trnL1（CUN）和trnV之间或trnV和A+T富集区之间存在2个rRNA基因（rrnS和rrnL），二者的大小分别为1 359 bp和793 bp，A+T含量为84.5%，AT偏向略正，GC略负。

2.4 非编码区和基因重叠区

非编码区指不能转录出对应信使RNA（mRNA）的核苷酸序列，即其不能指导蛋白质的合成，含有参与转录、复制的调控元件。鳞翅目的线粒体基因组非编码区包括控制区和基因间隔区。

控制区的A+T碱基含量较高，因此，控制区又被称为A+T富集区或D-loop区。它是动物线粒体基因组的复制起始区，也是线粒体中最大的调控、复制、转录且不编码蛋白的核酸序

列[29]。鳞翅目昆虫线粒体基因组的控制区主要包含5个元素：5′-端的poly T结构、轻链复制起点、类似微卫星的重复序列、高度变异区、靠近tRNAMet上游的一段poly A或poly T结构[30]。在大多数鳞翅目昆虫线粒体基因组中，还存在着一段保守的特征序列：ATTTA，它位于控制区中间部分类似微卫星的重复序列前[31]。不同物种的控制区长度不同，控制区的长度取决于线粒体基因组总的长度大小。褐边绿刺蛾的控制区长度为373 bp，黄刺蛾的控制区长度为401 bp，二者控制区均位于rrnS和trnM基因之间，在它们的控制区中发现，几个保守结构中包括1个“ATAGA”序列，并且包含rrnS基因下游的1个poly T延伸和trnM基因上游的poly A延伸。此外，在黄刺蛾的控制区还发现了微卫星（AT）10元素位于富含A+T的区域，并且发现了3个串联重复序列。黄刺蛾A+T富集区A+T碱基含量最高为93.3%，AT偏向和GC偏向均为微负。

在A+T富集区还存在着基因间隔区，它是编码基因之间存在的非编码区域，数目不等、长短不定[32]，据研究了解，线粒体基因组大小进化朝着减少的趋势发展，它的实现是基于对基因间隔区的消除或削减[33]。基因间隔区包含5个元素：ployT、[TA（A） ]n-like结构、茎环结构、茎环结构5′的ATA与3′的G（A）n结构以及下游GT富集区[34]。黄刺蛾线粒体基因组中包含167 bp的基因间隔序列，分布在17个区域，大小从1 ～50 bp不等，最长的间隔序列为50 bp位于trnQ和nad2基因之间，富含A+T。

基因重叠区是指同一段核酸序列可以转录得到多个mRNA编码不同蛋白质的基因区域。在鳞翅目线粒体基因组中也存在着长度较小、数目不等的基因重叠区域，一般仅由几个碱基对组成，如位于atp6和atp8之间7 bp的“ATGATAA”序列和位于trnW和trnC之间8 bp的“AAGCCTTA”序列。在黄刺蛾线粒体基因组中有6个位置的基因之间有29 bp重叠，其中最长的为位于trnW和trnC之间的9 bp重叠。

2.5 基因重排

基因重排指DNA的核酸序列发生重排的现象。基因重排可分为易位、倒置或原位倒置、基因重排、异位倒置4类。基因重排可以作为系统分析标记，也是昆虫进化角度分析所用的第二个重要数据。此外，基因重排的程度能够说明1个物种分子进化速率的快慢，基因重排越明显，分子进化速率越快[35]。鳞翅目昆虫线粒体基因中tRNA基因的排列始终处于保守状态，仅有部分基因簇（trnM-trnl-trnQ）存在2种类型的排列方式（MIQ和IQM）[36]。IQM的复制可能导致IQMIQM的重排，第一次复制中IQ和第二次复制中M的随机丢失可能产生了MIQ。这种重排可以通过串联复制随机损失（The tandem duplication-random loss，TDRL）模型解释[37]，AR的易位可能是通过复制RA块实现的，从而导致RARA排列。后续第一次复制过程中丢失A，第二次复制过程中丢失R，导致AR被RA替换。

褐边绿刺蛾线粒体基因组中具有易位的基因重排现象，其重排方式为MIQ和一种导致“RANSEF”重排的独特重排方式。这2种重排方式均可以用TDRL模型进行解释。这种导致“RANSEF”重排的独特重排方式是在褐边绿刺蛾中发现的一种新重排方式。

据报道，在Astrotischeria sp.（Tisch-eriidae in Tischerioidea）线粒体基因组中有1个RNSAEF重排[38]，这种重排与褐边绿刺蛾的RANSEF相似，都涉及trnR和trnA区域，与鳞翅目其他昆虫形成对比。

3 讨论与展望

目前，褐边绿刺蛾线粒体基因组特点与大多数鳞翅目昆虫基本相同，但未对褐边绿刺蛾线粒体基因组中tRNA二级结构是否存在碱基错误配对现象、rRNA的位置大小、PCGs区域的终止密码子、A+T富集區是否存在串联重复序列、是否有基因间隔以及基因重叠区等方面进行分析。由此可知，褐边绿刺蛾的线粒体基因组序列还需更加充分、完整的分析。绿刺蛾属世界已知253种，我国已记载有46种，已报道的果树害虫有8种，但目前仅有褐边绿刺蛾线粒体全基因组得到了测序与分析，并且褐边绿刺蛾中线粒体基因组中发现了1种独特的基因重排。因此，绿刺蛾属中还需测定更多物种的线粒体基因组并分析其线粒体全基因组特点是否与褐边绿刺蛾一致。

黄刺蛾属世界已知7种，我国已记载有4种，但目前仅有黄刺蛾线粒体全基因组被测定。被测定的黄刺蛾线粒体基因组符合大多数鳞翅目昆虫的特点，但黄刺蛾线粒体基因组中是否存在基因重排现象，以及tRNA二级结构是否存在碱基错误配对现象仍有待进一步分析。

目前，线粒体基因组测序技术发展迅速，但对绿刺蛾属和黄刺蛾属线粒体基因组的研究不够深入。针对线粒体全基因组的研究不仅对刺蛾科昆虫的系统进化和物种起源的准确分析有至关重要的作用，还对刺蛾科昆虫害虫的快速鉴定、防治起着重要的指导意义，为保护植被、提高果树产量提供理论基础。

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Advances in Mitochondrial Genome Studies of Parasa and Cnidocampa （Lepidoptera Limacodidae）

Yan Jiu-yang et al（College of Life and Geographic Sciences， Kashi University， Kashi， Xinjiang 844006）

Abstract Eucleid caterpillar which belongs to Lepidoptera， limacodidae， Parasa and Cnidocampa is commonly known as hot pepper. They often harm fruit trees， greening trees， crops， etc. There were 9 kinds of harmful phenomena reported in China. The sequencing of mitochondrial genomes lays a foundation for the prevention and control of pests. This paper summarizes the methods of extraction and analysis of the mitochondrial genomes of the two moths， and summarizes the structural characteristics of their mitochondrial genomes， protein-coding genes， tRNA genes， rRNA genes， non-coding regions （control regions and gene interval regions）， gene overlap regions and gene rearrangement phenomena. At the same time， the progress of mitochondrial genome sequencing in the two genera is summarized， and the future sequencing work is also prospected.

Key words Parasa; Cnidocampa; Mitochondrial genome