超声协同气体杀菌技术在果蔬产品质量安全控制中的应用

沈谦君，潘佳能，孙晋跃，周文文

(浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058)

水果和蔬菜可以提供人类营养所需的膳食纤维、维生素、矿物质等，还具有抗氧化、调节身体免疫力、预防衰老、抵御疾病等功效。果蔬从田间到餐桌需要经过生产、采摘、分拣、质检、包装、配送、营销、售后加工等环节，这些环节都很容易被微生物污染[1]，果蔬中常见的致病菌有致病性大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等[2]，采后果蔬也容易感染青霉属、曲霉属、链格孢菌属、炭疽菌属和根霉属的真菌[3]。进食被污染的果蔬可对人的消化系统、神经系统等造成危害。与新鲜果蔬消费相关的食源性疾病暴发的高频率和高发病率是一个亟待解决的公共卫生问题。因此，如何控制果蔬中微生物的数量，保障果蔬质量安全就显得十分重要[4]。

杀菌是使微生物失活、保障果蔬安全最有效的方法之一。传统的热力杀菌技术多采用巴氏杀菌等外部加热进行杀菌，具有杀菌效果好、适用范围广等优点，已被广泛应用于果蔬的杀菌处理中[5]。然而，热灭菌技术会影响产品的质地、颜色和风味，并且在包装过程中容易造成二次污染[6]，因此，选择合适的加工技术代替热杀菌就显得十分重要。随着现代工业技术的发展和人们对果蔬产品质量安全要求的提高，非热灭菌技术的发展受到极大的推动。在各种新兴的非热杀菌技术(超高压、辐照、紫外照射、脉冲光照射、冷等离子体、超声波)中，超声波的研究已有数百年的历史[7]。目前，超声波杀菌已广泛应用于各类乳制品、肉制品、果蔬等食品中，在保障食品质量安全中起着重要的作用[8]。

超声波是指频率大于20 kHz的高频声波，可以引起空化作用以及一系列效应，如机械效应、热效应、化学效应等，使细菌毒力丧失或死亡。相较于传统的高温加热灭菌工艺，超声不会破坏食品的风味和成分[9]。超声波技术在抗菌应用中的最早研究始于1920年，前人证实了超声波技术对藻类微生物的作用[10]。超声波是一种绿色低碳的杀菌方式，已被证明对多种微生物具有杀菌作用，但其单独杀菌的作用效果有限。近年来，超声协同气体杀菌因其具有良好的协同杀菌效应，可以缩短杀菌处理的时间，降低能耗，同时减少对果蔬的不良影响等优点被广泛研究。本文综述了超声协同气体的杀菌作用机制及其在控制果蔬质量安全方面的应用，旨在为进一步研究基于超声波与气体杀菌的绿色组合技术，从而更好地为保障果蔬的质量安全提供参考。

1 超声空化及其杀菌方式

液体中的微小气泡在超声波的作用下会发生振动，当超声能量足够高时，就会发生空化作用，当能量达到一定阈值时，空化气泡会迅速坍塌并破裂，整个过程约为0.1 μs，可以释放巨大的能量并产生110 m·s-1的微射流和碰撞密度达到1.5 kg·cm-2的冲击力[11]。空化作用对细菌细胞结构的一系列强烈物理和化学影响(主要包括声穿孔、声化学和声致发光)会破坏细胞结构并导致蛋白质变性[12-13]。

1.1 声穿孔

超声波对细胞膜造成的物理损伤主要是由于声穿孔现象所导致的细胞膜通透性的增加[14]，使抗菌剂更容易通过孔隙进入细菌细胞，导致细胞中功能物质的泄漏，最终造成细胞死亡[15]。细菌对超声波的抵抗力与细菌的形状、大小、厚度、刚度有关[16]。然而，尽管高强度超声(HPU)处理会对细菌细胞造成不可逆的损伤，但空化作用介导的声穿孔通常不被认为是导致细胞死亡的决定性因素。因为在超声穿孔后膜的恢复过程中，随着Ca2+流入细胞的膜孔，胞内囊泡将开始积聚，从而重新闭合膜孔[11]。

1.2 声化学

声化学是指由声空化产生的自由基引发的一系列二次化学反应的现象。由于空化气泡在极短的时间内坍塌，泡内压缩气体产生的热能无法及时分散，从而将空化泡内的物质以及空化泡与液体之间的界面(液壁)加热到极高的温度，导致液体分子破裂，产生大量活性氧自由基(ROS)并释放到细胞周围的液体中[17]。研究表明，ROS及其代谢产物可以与蛋白质、脂质、多糖、核酸等各种细菌生物分子发生反应[18-21]。释放的ROS会与邻近细菌细胞膜反应，到达细胞内部，使细胞内部氧化压力失调，并与细胞内生物大分子反应，导致蛋白质变性、酶失活、脂质过氧化、DNA断裂，最终导致细胞死亡[22]。

1.3 声致发光

声致发光是指当液体中的气泡受到机械波的激发时，气泡爆裂并迸发出极短暂的亮光的现象。超声波在液体中传播时，在液体的负压区域，空化核会逐渐成长形成肉眼可见的微米量级的气泡，当空化气泡内部压力不断增强、温度持续上升时，会导致光的辐射。大量研究表明，惯性空化气泡突然坍塌产生的闪光可以激活声敏剂形成ROS[23]。声敏剂吸收声致发光产生的光能，跃迁到更高但不稳定的能量状态，在回到基态之前在与生物底物相互作用时释放能量并产生各种自由基(过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基和单线态氧)，这些分子共同作用导致微生物死亡[24-25]。在应用声动力杀菌的实践中，铁-氧化锌纳米颗粒作为声增敏剂，可以有效控制水中志贺氏菌和沙门氏菌的微生物污染，为绿色果蔬产品供给链中用水部分的安全提供参考[26]。

基于超声空化效应所致的声穿孔、声化学、声致发光3种现象，超声对细胞的强致死作用可以得到较好解释：超声波空化效应导致的局部瞬时高温高压会使胞内蛋白质变性，声穿孔可破坏细胞膜结构，增加其通透性，导致细胞内有机质渗漏；声化学反应和声增敏剂的活化会产生ROS等自由基，对细胞内聚合物产生不可逆的破坏性作用(图1)[27]。这也为超声协同气体杀菌技术在对果蔬的应用提供了理论支持。

图1 超声处理的杀菌机制

2 超声联合气体的协同抗菌及其在果蔬质量安全控制中的应用

2.1 O3协同

O3是一种具有高氧化电位(2.07 eV)的良好消毒剂。O3的自由基链在衰变过程中形成的羟基自由基和活性氧(ROS)被认为是O3能够杀灭细菌的主要原因[28]。近年来，超声协同O3杀菌方法在果蔬中的应用已得到广泛研究，为超声协同O3杀菌技术提供了进一步的理论指导和实验数据，证明了超声协同O3处理是一种高效安全、绿色低碳的技术，可以在保证果蔬营养价值的同时实现微生物的有效灭活，保障果蔬的质量安全。超声联合O3的良好协同效应可以从以下两个方面解释：首先，超声波会粉碎O3气泡，提高O3的溶解速率和单位体积内O3的浓度，高浓度的O3能够迅速杀死微生物[29]；其次，超声波空化作用造成的局部高温高压在促使水分子分解产生自由基的同时也会促进O3分解产物在室温和压力下由氧化性较弱的O2转化为氧化性极强的·OH-(羟基自由基)，从而杀死微生物[30]。

Maryam等[31]和Aday等[32]均研究了超声波和O3协同处理对草莓微生物的杀菌效率和营养成分的影响。研究发现，O3和超声协同处理可以有效杀灭草莓中98%的细菌，且草莓中抗坏血酸、花青素的含量和抗氧化酶活性也能得到很好保留。Taiye Mustapha等[33]研究低浓度O3水溶液和多频超声的协同作用对樱桃番茄中的腐败微生物和质量影响，也得到了类似结果。Sun等[34]就O3水溶液和超声(28 kHz)协同和单独作用对鲜切生菜中致病微生物的杀灭效果进行了对比实验，发现协同超声处理在更高效杀菌的同时还可以将总处理时间减少约20 s。Traore等[35]的实验证明了O3协同超声(40 kHz，100 W)仅需8 min即可充分杀灭卷心菜中的细菌，并且不会损伤其叶片。在使用3.33 mg·min-1的O3和40 kHz的超声处理新鲜菠菜10 min后，菠菜中总细菌数(细菌总数、大肠埃希菌、沙门氏菌和李斯特菌)减少了1.46 lg(CFU·g-1)[36]，减少量近94.04%，而当使用相同的条件处理番茄5 min后，番茄中总菌落减少了1.76 lg(CFU·g-1)[37]。

除此之外，超声作为绿色高效的去污剂[38]，其协同O3在去除果蔬表面的农药残留中表现也十分优秀，一项研究评估了超声协同O3在去除莴苣上的甲胺磷敌敌畏的效能，发现去除率高达82.16%[39]。菠菜上的噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒在3.33 mg·kg-1的O3和40 kHz的超声处理10 min和15 min后，残留农药去除率可分别达94.04%和99.77%[40]。这些结果均证明了超声协同O3是一种保障果蔬质量安全的新型绿色高效技术。

2.2 ClO2协同

ClO2是一种氧化性气体，通常由氯酸钠和酸/氯反应产生。ClO2对细菌、真菌和病毒都具有抗菌作用，作为氯气的替代品，它的氧化能力是氯气的2.5倍，且不会形成致癌副产物[41]。目前已有许多实验研究证明了超声协同ClO2灭菌的效能和机理。在HPU(60 W)和ClO2(4 mg·L-1)的协同作用下，10 min后金黄色葡萄球菌的灭活率就可达99.03%，并且金黄色葡萄球菌的生物膜也能得到有效的分离和清除。而有一半的金黄色葡萄球菌在单独用ClO2处理10 min后仍处于亚致死状态；单独使用HPU处理的杀菌率更差，仅有18.72%[42]。关于超声协同ClO2灭菌的机理，研究证明经超声波破碎后，水中较大的悬浮颗粒会分解成小颗粒，从而更均匀地分散在水中，与杀菌剂完全接触[43]。超声波的空化作用还会增加细菌细胞膜通透性，使ClO2更容易进入细胞[44]。此外，超声波诱导产生的ROS和ClO2会对细菌细胞产生双重氧化作用，ClO2的加入将放大超声波导致的细菌细胞蛋白质损失和渗透压失衡的情况，影响细胞内小分子代谢过程，从而加剧细菌细胞内稳态的失衡，造成细胞死亡[22]。Murphy等[45]则提出了超声协同ClO2杀菌的另一个可能机制，他们认为HPU会激活细胞中用于交换营养物质、废物和代谢产物的通道，从而使ClO2渗透到生物膜的深层。

如今，超声协同ClO2灭菌作用的应用实践主要集中在生鲜果蔬中。Millan-Sango等[46]评估了超声波协同ClO2水溶液对苜蓿和绿豆中大肠埃希菌和肠炎沙门氏菌的杀菌效果，实验结果表明，协同处理可分别减少苜蓿和绿豆中的沙门氏菌和大肠埃希菌。在ClO2协同超声对西兰花中污染微生物的处理实验中，ClO2协同超声的杀菌效果显著高于单独使用ClO2和使用超声作为前处理或后处理手段(超声/ClO2或ClO2/超声)[47]。Wu等[48]探究了ClO2和超声波处理对大白菜保质期、营养成分和生物活性化合物的综合影响。结果证明，协同处理分别将大白菜中假单胞菌数目和细菌总数减少了2.8 lg(CFU·g-1)和2.5 lg(CFU·g-1)，大白菜的外观、颜色、叶绿素含量、总抗坏血酸和酚类含量在12 d的贮存期内都可以得到有效保护。Chen等[49]研究了ClO2水溶液和超声波对李子的处理效果。ClO2单独处理组中的李子在储存40 d后，霉菌含量就超过了标准值，协同处理组储存的60 d中李子的霉菌含量一直在可接受范围内，表明超声可以增强ClO2的抗菌效果。这些结论都表明了ClO2协同超声杀菌是保障果蔬质量安全、提高果蔬营养价值的有效手段。

2.3 超临界CO2协同

由于CO2临界温度和压力低，所以CO2的超临界状态(SC-CO2)很容易达到。SC-CO2能够酸化细胞，使酶失活，在灭活各种微生物如大肠埃希菌、酿酒酵母等方面表现良好，已被用于乳制品、禽肉类和果蔬类食品的杀菌[50-52]，但要达到与传统热杀菌相似的灭活水平，SC-CO2需要的时间较长，难以满足实际食品加工生产的需要。因此，将其他非热灭菌技术与SC-CO2协同是SC-CO2灭菌技术的发展趋势。

超声是最常与SC-CO2联用的技术[53]，超声能提高SC-CO2杀菌效果的原因被认为是超声波场产生的剧烈搅拌作用和空化效应不仅会提高SC-CO2在液体中的溶解速率，还会损伤细菌和酵母菌细胞的细胞膜和细胞壁，增强SC-CO2向细胞内部的传质和渗透，继而细胞活性所必需的胞内物质被SC-CO2抽提[54]。Paniagua-Martínez等[55]发现，SC-CO2协同HPU可以减少橙汁中的大肠埃希菌和好氧嗜温菌，酿酒酵母在处理后也减少了99.7%。Ortuo等[56]评估了SC-CO2协同HPU对不同细菌(大肠埃希菌和缺陷假单胞菌)和真菌孢子的灭活效果和机制。他们发现经SC-CO2协同HPU处理细胞的细胞壁和细胞膜塌陷变形，细胞质内容物泄漏严重。

超声协同SC-CO2技术能有效抑制微生物繁殖，对果蔬有良好的杀菌保鲜效果。Michelino等[57]发现与单独使用SC-CO2相比，协同HPU可以实现对香菜更快地脱水杀菌。Gomez-Gomez等[58]在超临界流体装置中试验了一种基于HPU的新型灭活技术，协同使用SC-CO2和HPU时，细菌数目减少8 lg(CFU·g-1)，所需时间减少了95%。他们还探讨了是否可以通过SC-CO2和HPU的结合来实现脂质乳液的非热巴氏灭菌，结果表明，HPU可以降低油脂在灭活中对细菌的保护作用，增强SC-CO2的杀菌能力，是对含有热敏物质的脂质乳剂进行灭菌的一种有效方法。当SC-CO2与HPU协同灭菌时，椰子水中的细菌在处理15 min之后减少了5 lg(CFU·g-1)，并且HPU可以有效地改善椰子水在灭菌后不够稳定、微生物在储存过程中容易再生的情况，将椰子水的保质期延长到28 d[59]。

2.4 MAP(改良气调包装)协同

MAP包装(modified atmosphere packaging)是在真空包装以及充氮包装的基础上发展改进所得到的一种主要用于食品保鲜的包装。通过调节不同比例的气体成分(通常为N2、O2、CO2)，MAP可以起到保持食品质量，延长保质期的作用。一般来说，3%～6% O2和2%～10%CO2可以抑制微生物的生长，延长新鲜产品的保质期。其他气体，如氦气、氩气和氙气(稀有气体)，以及一氧化二氮(N2O)，也会被用于MAP中[60]。

尽管MAP协同超声对微生物生长抑制作用的机理尚未清楚，但对其在果蔬上应用的结果评估足以证明MAP协同超声处理是一种优秀的果蔬保鲜技术。在6%的O2、4%的CO2和90%的N2的气调下，使用超声(20 kHz，180 W)处理番茄和丝瓜5 min，可以有效减少果实中丙二醛的积累量，且果实的硬度、水分和抗坏血酸含量在处理前后基本没有变化[61]。将MAP协同超声运用到采后番石榴中也得到了类似的结果，储存30 d后番石榴保鲜率仍可达81.82%[62]。

在MAP协同超声对果蔬贮存期间各类腐败微生物生长繁殖的抑制作用研究中，Zhang等[63]的实验结果表明，MAP协同超声处理10 min后，大白菜的初始细菌计数从7.11 lg(CFU·g-1)降低到6.01 lg(CFU·g-1)，MAP协同超声还可以有效降低大白菜中过氧化物酶和多酚氧化酶的活性，延长保质期。超声协同MAP对鲜切生菜微生物及品质性状的影响实验中[64]的结果表明，MAP协同超声能有效抑制贮藏期间生菜细菌、霉菌和酵母菌的生长。Fan等[65]研究了超声波处理对鲜切黄瓜在MAP包装贮藏过程中微生物和品质的影响，结果表明，超声可以抑制新鲜黄瓜储存过程中总细菌菌落、霉菌和酵母菌的生长，是改善鲜切黄瓜常压包装防腐效果的有效方法。

2.5 VOCs(EOs)协同

从植物中提取到的挥发性化合物(VOCs)(也被称为精油EOs)，自古以来就因其高效的抗菌活性而备受关注，至今仍是生物医学研究的热门方向[66]。挥发性植物化合物主要可以分为萜烯、含氮化合物、芳香族挥发物和脂肪氧化酶途径产生的衍生物。它们被认为可以作用于微生物的细胞膜，影响细胞膜完整性和渗透性[67]。例如，萜烯会通过与磷脂中的酰基链结合破坏细胞膜，导致电解质和离子的泄漏[68]，芳香族化合物(尤其是苯丙素类)会与膜蛋白结合，改变它们的构象[69]。

由于气相EOs可以与食品表面直接接触，抗菌作用比液相更强，因此，已经有不少研究利用气相中的EOs作为保鲜储存果蔬的抗菌剂[70]。气相EOs对培养基中和萝卜芽表面的李斯特菌的抗菌活性的对比实验表明，在培养基中具有显著李斯特菌抗菌活性的气相EOs在萝卜芽表面也表现出相应的致死活性[71]。Shao等[72]评估了气相芥末精油对番茄中黑曲霉的抑制作用，体外和体内的实验结果均证明了芥末精油蒸气对抗黑曲霉的有效性，并且不会损害番茄的感官特性，是传统合成抗菌剂的良好替代品。基于此开发出高效合理的精油提取技术对于增强精油抗菌能力是十分重要的，与传统的浸渍提取、索氏提取相比，超声辅助提取(UAE)可以缩短提取时间和提高提取效率，并且不对提取物的结构、活性产生影响，操作简单易行，有效成分易于分离纯化[73]。许多研究证实，超声辅助提取精油可以增强其抗氧化、抗菌活性，但其具体机制尚未明确。

3 结论与展望

超声协同气体杀菌技术能够充分保存果蔬的营养物质，具有高效低碳、绿色环保的优点，符合消费者追求的无污染、优质的消费理念。然而，超声协同气体灭菌技术目前还不成熟，在大规模的推广和应用方面面临着诸多挑战。目前大部分研究均基于细胞表观的机械性损伤电镜和物化特性分析，而在分子水平上，如通过调控细胞代谢凋亡的相关基因在超声协同气体作用下的变化来阐述微生物失活的相关研究较少。在今后的研究中，一方面要进一步加深对超声协同气体杀菌的机理探索，另一方面要将其运用于更多果蔬产品中，持续观测、检测分析果蔬在一段时间的贮藏过程中腐败菌、致病菌以及各类营养物质含量的变化，对食品营养品质及安全性进行综合评估及预测，为工业化提供参考价值。此外，超声协同气体还可与更多的杀菌剂或非热杀菌技术结合使用，例如可以将微波技术运用到超声和气体的协同处理过程中，也会是一个较有前景的研究方向。