永康市金黄色葡萄球菌感染情况及7种中草药体外抑菌效果研究

吕美艳，方杭，陈俊，王蔚，徐象威

1. 永康市第一人民医院检验科，浙江 永康 321300；2. 永康市第一人民医院科教科，浙江 永康 321300

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）耐药性主要由甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）获得了可以在金黄色葡萄球菌染色体间进行转移的编码甲氧西林耐药性基因盒元件（SCCmec）而产生[1]，是公共感染和医院感染的最重要病原体之一，MRSA 具有异质性和广谱耐药性[2]，不仅对β-内酰胺类抗生素耐药，而且对四环素或氟喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素也有耐药性，临床上通常用万古霉素作为经典治疗手段，同时也认为万古霉素是治疗金黄色葡萄球菌感染的“最后防线”[3]，但是国外已经发现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌，所以寻找新型抑菌药或抑菌策略依旧刻不容缓，许多文献报道含有黄酮类、生物碱类、多酚类、蒽醌类和有机酸类等天然产物具有抗耐药菌活性[4]，应用天然产物含有的化学物质作为抗生素增效剂以提升抗生素效用，减缓耐药性细菌传播或降低耐药性，已成为当前医学研究热点。本研究收集2020—2022 年永康市第一人民医院就诊患者中分离的金黄色葡萄球菌株，了解其耐药情况，筛选不同中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，以期获得一种对金黄色葡萄球菌抑菌效果好的中药，为后期天然植物抑菌药开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂 收集2020 年10 月—2022 年9 月分离自永康市第一人民医院就诊患者的794 株金黄色葡萄球菌，-70 ℃保存，质控菌金黄色葡萄球菌ATCC25923 购自国家卫生部临床检验中心，MSSA 和MRSA 菌株来自于永康市第一人民医院-70 ℃保存的细菌室。

1.2 菌株分离鉴定与药敏试验 样本按照《全国临床检验操作规程》进行分离、培养和鉴定，使用法国生物梅里埃公司的VITTEK MS 质谱仪进行细菌鉴定和VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统进行药敏试验，药敏结果根据CLSI M100 进行折点判断。

1.3 统计学方法 WHONET 5.6 统计方法分析金黄色葡萄球菌分布和耐药情况。数据采用SPSS22.0 软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，3 组以上比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.4 体外抑菌活性实验

1.4.1 菌悬液配制 取出在-70 ℃冰箱冻存的菌株，接种于血琼脂培养基，在35 ℃培养箱中过夜培养，待长出单个菌落后，用无菌接种环挑取单个菌落于0.45%氯化钠溶液中，配制菌液浓度为1.0×108CFU/mL。

1.4.2 实验试剂及设备 试剂：二甲基亚砜（西陇科学股份，批号200314）；无水乙醇（无锡市晶科化工，批号20190701）；庆大霉素药敏纸片（英国OXOID 公司，批号20142405149）；环丙沙星药敏纸片（杭州滨和微生物试剂，批号20172400206）；MH培养基（郑州安图生物，批号20220415B）；Mueller-Hinton Broth（温州市康泰生物，批号VG2308G）。设备：GZX-GFC101-2-BS 型电热鼓风干燥箱（上海博泰实验设备）；SB-1300 型恒温水浴锅（上海爱郎仪器）；N-1300 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器）；生化培养箱（上海博迅实业）；电控高温接种灭菌锅（天津开发区合普工贸）；生物安全柜（济南鑫贝西生物技术）；梅里埃公司的VITTEK MS 质谱仪；梅里埃公司VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统。

1.4.3 中草药鉴定 7 种中草药由湖南中医药大学周旭东教授鉴定，采购于上海康桥中药饮片有限公司。其中，连翘产自山西（批号：220205），金银花产自山东（批号：220129），广藿香产自广西（批号：220111），黄芩产自吉林（批号：220213），黄连产自四川（批号：220215），杜仲产自湖北（批号：220207），对节白蜡树来源于湖北荆州（批号：220212）。

1.4.4 提取方法 文献报道7 种中草药均具有体外抗金黄色葡萄球菌作用，中草药中含有香豆素类、木脂类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类、黄酮类、甾醇及三萜类等[4-7]成分，所以选择提取挥发物、水提液和有机物提取液进行实验效果比较。挥发油制备：称取中草药粉末100 g 于圆底烧瓶中，加入300 mL蒸馏水，浸泡1 h 后，使用挥发油提取器回流提取约3 h 至不再有挥发油增加，所得挥发油于4 ℃保存备用。水提物制备：称取100 g 中草药粉末加入300 mL蒸馏水，浸泡1 h 后煎煮，煮沸后文火煎1 h，4 层纱布初步过滤后，重复操作2 次，滤液合并后旋转蒸发浓缩至干膏，放入真空干燥机冻干成粉，备用。有机物提取物制备：根据文献报道[8]及前期对乙醇和二甲基亚砜实验数据显示，15%浓度的二甲基亚砜作为溶剂，对菌株干扰最低，同时对中草药抑菌活性成分提取效果最佳，故取100 g 中草药粉末于300 mL 15%浓度二甲基亚砜溶液中，浸泡1 h 后回流提取1 h，4 层纱布过滤后重复操作2 次，滤液合并后旋转蒸发浓缩至干膏，放入真空干燥机冻干成粉，备用。

1.4.5 K-B 纸片扩散法药敏实验 实验菌株为金黄色葡萄球菌标准菌株（编号为ATCC29213）、MSSA 和MRSA。参照美国CLSI 抗菌药物敏感试验执行标准，水提物、有机物提取物以相同试剂将冻干粉配置成100 mg/mL 母液，挥发物使用原液进行试验，每个纸片直径6 mm，定量载样20 μL，以相同溶剂制备纸片作为阴性对照，待纸片晾干后备用，阳性对照选用环丙沙星和庆大霉素，35 ℃培养箱中培养16～24 h 测量抑菌圈直径，判断标准：无抑菌性（6 mm），中度敏感（7～10 mm），高度敏感（＞10 mm），每组实验重复3 次。

1.4.6 提取物浓度对金黄色葡萄球菌株抑菌活性的影响 中草药水提物用超纯水稀释，有机物提取物以15%二甲基亚砜稀释，通过实验初步获得提取物较低抑菌浓度进行最低抑菌浓度（MIC）实验，水提物、有机物提取物浓度范围按照1.4.4 方法配制为6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL，以溶剂为阴性对照，实验重复3 次。

1.4.7 微量肉汤稀释法药敏实验 选取庆大霉素作为阳性对照，对萃取组分进行MIC 测定，同时选用医院分离的10 株MRSA 作为测试菌，以验证对节白蜡树有机物提取物对本地MRSA 的抑菌效果，以15%二甲亚砜为溶剂将提取物配制成浓度为5 120 μg/mL 储备液，超纯水将庆大霉素配制成浓度为1 024 μg/mL 储备液，96 孔板首孔分别加入200 μL药物，第2～第10 孔分别加入100 μL MH 肉汤培养基（MHB）肉汤，第11 孔加入200 μL 菌液作为菌液对照，第12 孔加入200 μL MHB 肉汤作为阴性对照，第1 ～第10 列的提取物最终浓度配制成5 120 μg/mL、2 560 μg/mL、1 280 μg/mL、640 μg/mL、320 μg/mL、 160 μg/mL、 80 μg/mL、 40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL，抗生素第1～第10 列的终浓度分别为256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL。放置35 ℃培养箱培养16～24 h 后获得最低浓度即为化合物的MIC 值。

2 结果

2.1 永康市MSSA 及MRSA 分布情况 见表1。共检出MSSA 和MRSA 合计794 株，其中MSSA 检测出586 株，占比73.80%，MRSA 检测出208 株，占比26.20%，均以痰液检出占比最多，其次是分泌物、脓液、血液。

表1 永康市MSSA 及MRSA 分布情况

2.2 MRSA 及MSSA 对常见抗菌药物耐药情况 见表2。MRSA 对青霉素G、苯唑西林完全耐药，对红霉素、克林霉素耐药率较高，对替加环素万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺完全敏感，对利福平、复方新诺明、莫西沙星和庆大霉素敏感率均大于80%。MSSA 对青霉素G 和红霉素耐药率较高，对苯唑西林、替加环素万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺完全敏感，对利福平、复方新诺明、莫西沙星、左旋氧氟沙星和庆大霉素敏感率均大于90%。

表2 MRSA 及MSSA 对常见抗菌药物耐药情况 %

2.3 7 种中草药对金黄色葡萄球菌抑菌活性情况见表3。纸片扩散法是指药物经过琼脂扩散分布在培养基表面，纸片周边形成无菌落或少量菌落生长的透明半径圈，据此粗略判断受试药物的抑菌效果，7 种中药的水提物和有机物提取物均对3 种金黄色葡萄球菌抑菌效果，其中，有机物提取物中对节白蜡树对金黄色葡萄球菌、MSSA 和MRSA 的抑菌效果最好，其余中草药的有机物提取物及水提物抑菌效果较对节白蜡树差，所以，本研究选择对节白蜡树水提物和有机物提取物作为MSSA 和MRSA 实验的主要研究对象，以验证对节白蜡树在MSSA 和MRSA中的抑菌效果。

表3 7 种中草药对金黄色葡萄球菌抑菌活性情况（） mm

表3 7 种中草药对金黄色葡萄球菌抑菌活性情况（） mm

注：①与相同提取方法的其他中草药比较，P＜0.05；②与同草药水提物比较，P＜0.05

中草药名称连翘金银花广藿香黄芩黄连杜仲对节白蜡树庆大霉素环丙沙星阴性对照金黄色葡萄球菌MSSA MRSA水提物7.23±0.03 8.71±0.37 7.12±0.48 9.75±0.39①8.36±0.36 8.49±0.47 9.46±0.54①20.72±0.27 20.35±0.78 6有机物提取物7.83±0.76 7.34±0.20 9.44±0.61 9.33±0.30 10.38±0.56 9.58±0.06 12.26±0.76①②23.76±0.85 21.35±0.18 6挥发油6 7.51±0.69挥发油挥发油6 6 6 6 6---水提物7.08±0.32 7.16±0.57 7.12±0.48 8.43±0.81 8.14±0.25 8.22±0.30 9.15±0.24①20.22±0.34 19.79±0.81 6有机物提取物7.46±0.11 7.55±0.63 8.58±0.09 8.76±0.18 9.08±0.40 9.17±0.17 10.45±0.66①②22.36±0.55 22.67±0.40 6 6 6 6 6 6 6 6 7.33±0.05 7.98±0.15 6 7.05±0.98---水提物6 7.76±0.62 7.66±0.33 7.58±0.21 8.12±0.59 7.19±0.50 8.83±0.48①19.38±0.79 19.19±0.28 6有机物提取物7.64±0.47 7.45±0.63 7.67±0.29 8.69±0.45 8.18±0.42 8.55±0.11 10.02±0.33①②20.76±0.92 20.77±0.09 6 6 6 6---

2.4 对节白蜡树提取物浓度对MSSA 及MRSA 抑菌效果 见表4。对节白蜡树水提物及有机物提取物对MSSA 和MRSA 抑菌圈大小随着提取物浓度升高而增大，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中，有机物提取物对MRSA 抑菌效果好于水提取物，进一步证明对节白蜡树对MSSA 和MRSA 均有抑菌效果，并且有机物提取物工艺更具有研究价值。

表4 对节白蜡树提取物浓度对MSSA 及MRSA 抑菌效果（）mm

表4 对节白蜡树提取物浓度对MSSA 及MRSA 抑菌效果（）mm

注：①与相同菌株的对应浓度水提物比较，P＜0.05

MRSA 7.59±0.26 8.63±0.74 8.71±0.28 9.33±0.21 11.78±0.50 12.35±0.74 7.39±0.46①8.90±0.62①9.55±0.24①9.79±0.22①10.86±0.76①13.82±0.51①6提取物种类水提取物有机物提取物浓度（mg/mL）6.25 12.5 25 50 75 100 6.25 12.5 25 50 75 100阴性对照MSSA 7.35±0.54 7.07±0.42 8.78±0.45 10.32±0.93 10.36±0.11 11.63±0.62 7.57±0.16①7.83±0.40①8.44±0.18①9.39±0.17①10.32±1.09 10.65±0.94①6

2.5 对节白蜡树提取物对MSSA 及本地检出10 株MRSA 的MIC 测定 见表5。为了进一步验证对节白蜡树对本地区检出的MRSA 抑菌效果，随机选取10 株MRSA 作为研究对象，采用对节白蜡树提取物检测其MIC，实验结果显示，对节白蜡树有机物提取物对MSSA 和10 株本地区筛选的MRSA 均具有良好抑菌效果，MIC 值在640 μg/mL～1 280 μg/mL之间。

表5 对节白蜡树提取物对MSSA 及本地检出10 株MRSA 的MIC 测定 μg/mL

3 讨论

随着抗菌药物的滥用，致病菌的耐药性不断升高，日本和美国先后发现了对万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌株[9]。选择有效的新型药物或者方法控制MRSA 感染是当前众多学者关注的焦点之一，据统计，仅2016—2019 年已发现包含微生物、海洋生物和植物来源的256 种生物具有抗菌活性[10]。有文献报道，连翘、金银花、杜仲、藿香、黄芩和黄连等中草药具有较好的抗MRSA 活性[11-12]。对节白蜡树属木犀科梣属植物，落叶大乔木，是珍贵的药材树种，在我国传统中医药中多以其树皮入药称为秦皮，主要功效为清热燥湿、收涩、明目，用于热痢、泄泻[13]。目前研究报道花白蜡树、大叶白蜡树、秦岭白蜡树和苦枥白蜡树等植物提取物均具有体外抗菌、抗氧化、抗光照损伤、抗病毒等药理活性[14-15]。王蕾等[16]研究发现秦皮乙素对肺炎克雷伯菌具有良好的体外抗菌效果，陈鹏举等[17]研究报道秦皮水提物与部分抗菌药联合使用对含fosA3 大肠杆菌具有更好地抑菌效果，但是目前较少有关于对节白蜡树体外抑菌效果研究的报道，本研究通过对几种中药抑菌效果的比较，选取对金黄色葡萄球菌具有良好抑菌效果的中草药作为研究对象进行研究。

永康市金黄色葡萄球菌感染样本来源最多的是痰液，与陈兴英等[18]和谢红意等[19]报道的痰液占比最多一致，因为金黄色葡萄球菌普遍存在于鼻咽及皮肤表面，最容易引起呼吸道感染；其次是分泌物、脓液和血液，这可能由于外科手术等侵入性操作中导致患者黏膜受到损伤，细菌趁机侵入而导致感染有关；MRSA 对青霉素G、苯唑西林完全耐药，对红霉素、克林霉素耐药率较高，对替加环素、万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺完全敏感；MSSA 对青霉素G 和红霉素耐药率较高，对苯唑西林、替加环素、万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺完全敏感，说明本地区未出现对万古霉素和利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌，万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺仍然可以作为治疗MSSA 和MRSA 感染的首选药物，但是在高剂量使用时必须严密监测肝肾功能等生化检测指标，以保证治疗安全[20]。

我国有悠久的中药使用历史，越来越多的中药活性成分被发掘和利用，本研究团队通过前期文献查询[11-12]，选择连翘、金银花、杜仲、藿香、黄芩、黄连和对节白蜡树，均通过水提、有机物提取和挥发物提取法获得其提取物进行体外抑菌实验，实验结果表明，7 种中草药的水提物和有机物提取物均具有抑菌效果，但是对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的水提物和有机物提取物均是对节白蜡树，并且有机物提取物效果更好，可能与文献报道从对节白蜡树活性部位分离得到多个单体化合物，如五环三萜类化合物等，具有抗菌、抗病毒、调节血糖和降血压等药理作用[21-22]有关；对节白蜡树有机物提取物对MSSA 和MRSA 的抑菌浓度表明，对节白蜡树有机物提取物在较低浓度（6.25 mg/mL）下对MSSA 和MRSA均具有抑菌效果；进一步通过对节白蜡树提取物对MSSA 和本地检出10 株MRSA 进行MIC 测定研究，得出对节白蜡树提取物不仅对金黄色葡萄球菌ATCC29213 具有抑菌效果，而且对MSSA 和MRSA也具有较好的抑菌效果，但是具体的抑菌活性成分和抑菌机制需要进一步研究确定。

综上所述，永康市金黄色葡萄球菌样本主要来源痰液、分泌物、脓液和血液，MRSA 对青霉素G、苯唑西林完全耐药，对红霉素、克林霉素耐药率较高，对替加环素、万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺完全敏感；MSSA 对青霉素G 和红霉素耐药率较高，对苯唑西林、替加环素、万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺完全敏感，万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺可以作为治疗MSSA 和MRSA 感染首选药物，7 种中草药提取物体外抑菌效果实验表明对节白蜡树有机物提取物对MSSA 和MRSA 均具有较好的抑菌效果，该种中草药可能具备作为新型抑菌药物进一步探讨开发的价值。