血耳伴生菌胞外多糖的抗氧化活性及吸湿、保湿性能

何林蔓，柳宜池，陈莎，高梦祥，2，李利，2*

（1.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025；2.长江大学食品研究院，湖北 荆州 434025）

血耳（Tremella sanguinea Peng），又称血银耳，是一种生长于枯木上的药食兼用大型胶质真菌，子实体以耳片状丛生，鲜时呈暗赤褐色，干后黑色，浸水后渗出琥珀红色色素，故称血耳[1]。血耳作为食药兼用真菌，在湖北省西北部山区具有较长栽培历史，具有益气活血、平肝阳、祛热毒的功效，常用于肝炎、痢疾以及妇科诸症的治疗[2]。

1990 年彭寅斌根据血耳的形态特征对其进行分类，将其归属于银耳纲（Tremellomycetes）、银耳目（Tremellales）、银耳科（Tremellaceae）、银耳属（Tremella）[1]，与常见的食用菌银耳（T.fuciformis）、金耳（T.aurantialba）同属，亲缘关系较近。银耳属真菌中普遍存在伴生现象[3]。血耳、金耳、脑状银耳（T.encephala）、T.spectabilis 和T.steidleri 的伴生菌被鉴定为韧革菌（Stereum sp.）[3-5]，银耳的伴生菌为香灰菌（Hypoxylon sp．）[3]，T.mycophaga、T.obscura 和T.giraffa 的伴生菌为花耳属真菌（Dacrymyces sp.）[4]。银耳属的这种伴生现象实质为一种寄生关系，银耳属真菌为寄生菌，伴生菌为宿主菌。伴生菌具有较高的纤维素、半纤维素降解能力，能够分解木材，为银耳属真菌的生长发育提供营养和水分[3-5]。研究发现，许多银耳属的子实体是一种异质复合体，含有大量的伴生菌菌丝[3-4]。

银耳属食用菌中多糖含量极其丰富，被认为是其主要的活性成分，其中关于银耳多糖和金耳多糖的研究较多，被证实具有调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗衰老、降血糖、减肥及益生等多种功效[6-7]，开发利用前景十分广阔。近年来。血耳子实体多糖的抗氧化、抗炎症和调节免疫功能的活性也已被报道[8-10]。

食用菌多糖不仅可以从子实体中提取和分离，还可以从培养的菌丝体、孢子或发酵液中获取[11]。目前银耳属食用菌多糖的研究主要集中于子实体多糖和菌丝体、担孢子发酵产生的多糖，对其伴生菌多糖的研究鲜有报道[12]。本研究利用血耳伴生菌菌株韧革菌XE02 进行液态发酵制备胞外多糖，对多糖的抗氧化活性及吸湿、保湿性能进行研究，以期为血耳伴生菌活性物质的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

血耳伴生菌菌株[韧革菌（Stereum sp.）XE02]，通过耳木组织培养法从湖北省保康县马良镇水田村采集的血耳子实体中分离而得[5]。

葡萄糖、浓硫酸、苯酚、水杨酸、邻苯三酚、甘油、抗坏血酸（vitamin C，VC）、海藻酸钠（均为分析纯）、KBr（光谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；DEAE-52 纤维素：上海源叶生物科技有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，定容至1 000 mL；马铃薯培养基[13]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，定容至1 000 mL，pH6.0；大米培养基[14]：大米粉40 g，大豆粉10 g，KCl 0.15 g，KH2PO40.15 g，NaCl 0.15 g，定容至1 000 mL，pH6.0；葡萄糖培养基：葡萄糖50 g、蛋白胨5 g、KH2PO42.5 g，MgSO41.0 g，定容至1 000 mL，pH6.0；加富葡萄糖培养基：在葡萄糖培养基的基础上添加0.15%酵母浸出粉。培养基灭菌条件为121 ℃，20 min。

1.2 仪器与设备

Allegra X-30R 离心机：德国贝克曼公司；TU1900紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；HT7800 透射电子显微镜：日本日立科学仪器有限公司；IR-960 傅里叶红外变换光谱仪：天津瑞岸科技有限公司；Waters 1515 高效液相色谱仪、Waters 2410示差折光检测器：美国沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 血耳伴生菌的液态发酵

将韧革菌XE02 点接于PDA 培养基，30 ℃培养4 d进行活化。挑取5 块4 mm2大小的菌饼接入50 mL 液体培养基，30 ℃，200 r/min 培养3 d 得到种子液，再按照10%接种量转接至液体培养基中进行扩大培养，培养条件为30 ℃、200 r/min、7 d。

1.3.2 胞外粗多糖的提取

发酵结束后，发酵液经真空抽滤除掉菌丝体，收集滤液，于55 ℃减压浓缩至原体积的1/10，按100∶5的体积比加入30% H2O2，用1 mol/L NaOH 溶液调节pH值至9，在40 ℃下水浴1 h 进行脱色，得到澄清透明的粗多糖溶液。加入1/4 体积的Sevag 试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，体积比），磁力搅拌20 min 后，10 000 r/min 离心15 min，脱除蛋白质，重复3 次，收集上清液，加入无水乙醇，使体系中乙醇体积浓度达到80%，4 ℃静置过夜，10 000 r/min 离心15 min，获得粗多糖沉淀。将粗多糖沉淀用无水乙醇洗涤2 次，加入蒸馏水溶解，冷冻干燥后得到粗多糖。粗多糖的得率（P，g/L）按公式（1）进行计算。

式中：M粗多糖为粗多糖的干燥后质量，g；V 为用于提取多糖的发酵液体积，L。

1.3.3 多糖的分离纯化

0.1 g 粗多糖溶解在10 mL 蒸馏水中，上样至DEAE-52 纤维素层析柱（2.6 cm × 45 cm），依次用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，流速为1 mL/min，每7 mL 洗脱液收集一管。采用苯酚-硫酸法测量洗脱液的吸光值（A490nm），绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线将主要峰对应的洗脱液合并，依次进行减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到韧革菌多糖组分（Stereum exopolysaccharides，SEPS）。

1.3.4 紫外可见吸收光谱测定

将多糖样品配制成质量浓度为2 mg/mL 的水溶液，在200～600 nm 波长内，以1 nm 间隔进行扫描。

1.3.5 高效凝胶渗透色谱测定

配制质量浓度为5.0 mg/mL 的右旋糖酐标准品（分子量1 000、5 000、12 000、25 000、50 000、80 000、670 000 Da）和SEPS 溶液，过0.22 μm 微孔滤膜后采用高效凝胶渗透色谱法进行测定。采用示差折光检测器；色谱柱为Shodex OHpak SB-803 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-805 HQ（8 mm×300 mm）串联柱；流动相为0.05 mol/L NaCl 水溶液；流速0.6 mL/min；柱温40 ℃，进样量30 μL。采用Waters Empower 软件对结果进行分析，以标准品相对分子质量（molecular weight，Mw）的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得校正曲线。根据多糖组分的保留时间由校正曲线计算得到其分子量。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱测定

多糖样品1～2 mg 与KBr 固体充分研磨后压片，在4 000～400 cm-1的波数范围内进行扫描。

1.3.7 透射电子显微镜观察

参照王昭晶等[9]的方法，具体如下：1 mg/mL 的多糖水溶液，按质量比1∶1 加入1 mg/mL 十二烷基硫酸钠溶液，80 ℃恒温水浴2 h，用蒸馏水稀释至5 μg/mL，80 ℃继续水浴2 h。取1 滴分散好的多糖溶液加到300目铜网碳膜上，室温下自然干燥后在80 kV 电压下进行观察。

1.3.8 抗氧化能力测定

参照Zhang 等[15]的方法测定多糖样品的羟自由基清除能力，以VC为阳性对照。将1.0 mL FeSO4（9 mmol/L）、1.0 mL 水杨酸-乙醇溶液（9 mmol/L）和1.0 mL多糖样品（0～10 mg/mL）混合。加入1.0 mL H2O2（8.8 mmol/L）启动反应，37 ℃的水浴孵育1 h，测定510 nm 处吸光值，按照公式（2）计算羟自由基清除率（Sh，%）。

式中：A1为样品溶液的反应体系的吸光值；A2为用乙醇代替水杨酸-乙醇溶液的对照组吸光值；A0为用蒸馏水代替样品溶液的对照组吸光值。

参照Feng 等[16]的方法测定多糖样品的超氧阴离子自由基清除能力，以VC为阳性对照。将3.0 mL Tris-HCl 缓冲液（0.05 mol/L，pH8.2，含1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠）于试管中，25 ℃水浴孵育20 min，取出后立即加入2.0 mL 样品溶液（0～10 mg/mL）和1.0 mL 邻苯三酚（50 mmol/L），混匀，25 ℃水浴反应5 min，然后加入0.2 mL 浓盐酸终止反应，于320 nm 处测吸光值，按照公式（3）计算超氧阴离子自由基清除率（Ss，%）。

式中：A1为样品溶液的反应体系的吸光值；A2为用蒸馏水代替邻苯三酚溶液的对照组吸光值；A0为用蒸馏水代替样品溶液的对照组吸光值。

1.3.9 吸湿、保湿效果测定

按伍晓萍等[17]的方法，以常用的保湿剂甘油和海藻酸钠为对照，考察多糖的吸湿、保湿能力。称取多糖样品、甘油和海藻酸钠各0.5 g 于称量瓶中，将其放入置有饱和碳酸钾溶液（相对湿度43%）和饱和硫酸铵溶液（相对湿度81%）的干燥器内，25 ℃放置2、4、6、8、10、12、24 h 后，分别称量样品质量，按公式（4）计算吸湿能力（Ma，%）。

式中：W0为初始样品质量，g；W1为特定时间吸湿后的样品质量，g。

称取多糖样品、甘油和海藻酸钠各0.5 g 于称量瓶中，分别加入3 倍样品质量的去离子水，转动称量瓶直至样品将水分完全吸收。将称量瓶放入装有变色硅胶的干燥器（相对湿度0%）内，25 ℃放置2、4、6、8、10、12、24、36 h 后，分别称量样品质量，按照公式（5）计算保湿率（Mr，%）。

式中：H0为初始样品中的水分质量，g；H1为特定时间后样品中的水分质量，g。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2007 处理数据和统计分析，Origin 2018 软件进行绘图。试验数据均重复测定3 次。

2 结果与分析

2.1 血耳伴生菌胞外多糖的发酵制备

韧革菌XE02 在马铃薯培养基、大米培养基、葡萄糖培养基和加富葡萄糖培养基中进行液态发酵，其发酵液中多糖产量见图1。

图1 韧革菌XE02 在不同培养基中的胞外多糖产量Fig.1 Yield of exopolysaccharides by Stereum sp.XE02 in different media

由图1 可知，培养基成分对韧革菌XE02 的胞外多糖产量影响较大，其中，大米培养基为最优发酵培养基，胞外多糖产量为（1.62±0.05）g/L。在后续试验中均采用大米培养基为韧革菌XE02 胞外多糖的发酵培养基。

收集韧革菌XE02 在大米培养基中的发酵液上清，经H2O2脱色、Sevag 试剂脱蛋白、乙醇沉淀得到胞外粗多糖，得率为（1.1±0.2）g/L。采用DEAE-52 纤维素柱层析对粗多糖进行纯化，结果见图2 和图3。

图2 粗多糖的DEAE-52 纤维素柱层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of crude polysaccharides using DEAE-52 column chromatography

图3 SEPS 的固体状态和显微形貌Fig.3 Solid state and microscopic morphology of polysaccharides SEPS

由图2 可知，胞外粗多糖经DEAE-52 纤维素柱层析后，在NaCl 浓度为0 mol/L 时有1 个洗脱峰，表明韧革菌XE02 的胞外多糖主要为中性多糖。该中性多糖洗脱液经浓缩、透析除盐、冷冻干燥后，得到蓬松的白色絮状多糖组分SEPS，在透射电镜下，SEPS 的分子形貌呈长丝状（图3）。

采用紫外可见吸收光谱和高效凝胶渗透色谱分别对多糖SEPS 的纯度和分子量进行分析，结果见图4和图5。

图4 SEPS 的紫外可见吸收光谱Fig.4 Ultraviolet-visible absorption spectra of SEPS

图5 SEPS 的高效凝胶渗透色谱Fig.5 High performance gel permeation chromatogram of SEPS

由图4 可知，SEPS 在260 nm 和280 nm 处无明显的吸收峰，表明样品中不含或含极少量的蛋白质和核酸，纯度较高。由图5 可知，高效凝胶渗透色谱共检测到3 个洗脱峰SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3，保留时间分别为27.01、40.77、46.91 min，表明SEPS 为含有3 种不同分子量多糖的复合多糖。根据右旋糖酐标准品的lgMw-RT 校正曲线方程y=-0.166x+11.06（R2=0.995），计算得到SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3 相对分子质量分别为3.77×103、19.61、1.87 kDa。

2.2 胞外多糖SEPS 的傅里叶变换红外光谱分析

在4 000～400 cm-1的波数范围内对SEPS 进行了傅里叶变换红外光谱扫描，分析其特征官能团，结果见图6。

图6 SEPS 的傅里叶变换红外光谱Fig.6 Fourier transform infrared spectra of SEPS

由图6 可知，SEPS 在3 400、2 933、1 641、1 427、1 150、1 051、900、856、766 cm-1处均有吸收峰，具有多糖类物质的一般结构特征。其中，3 400 cm-1和2 933 cm-1附近的吸收峰分别为O-H 伸缩振动和C-H 伸缩振动[15]，二者是糖类的特征吸收峰；1 641 cm-1附近的吸收峰与多糖的结合水有关[10]，说明SEPS 对水有较强的亲和力；1 427 cm-1附近的吸收峰是C-H 的弯曲振动峰[15]；1 051 cm-1附近的吸收峰为吡喃糖环中C-O-C和C-O-H 的C-O 伸缩振动，766 cm-1为吡喃环的对称环伸缩振动[15]，表明SEPS 中单糖以吡喃糖苷的形式存在；900 cm-1和856 cm-1附近的吸收峰分别为α-糖苷键和β-糖苷键的吸收峰[15]，表明SEPS 同时存在α和β 两种类型的糖苷键。综上所述，SEPS 中的单糖组成为吡喃糖，含有β-构型糖苷键和α-构型糖苷键。

2.3 胞外多糖SEPS 的抗氧化活性

在正常情况下，人体中的自由基处在不断产生和不断消除的动态平衡中，一旦平衡被打破，就会对机体组织产生危害，进而引发肿瘤、衰老、心脑系统损伤等一系列相关疾病[17-18]。大量研究表明，真菌多糖是一类良好的天然抗氧化剂，可用于防止或减轻自由基造成的危害[18]。以羟自由基清除效果和超氧阴离子自由基清除效果为指标，评价了胞外多糖SEPS 的抗氧化活性，结果见图7 和图8。

图7 SEPS 对羟自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of SEPS on hydroxyl radical

图8 SEPS 对超氧阴离子自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of SEPS on superoxide anion radical

由图7 和图8 可知，随着浓度的升高，SEPS 的羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率不断升高，表明SEPS 的质量浓度与清除率呈量效关系。在10 mg/mL时，SEPS 的羟自由基和超氧阴离子自由基清除率分别约为68%和74%，说明胞外多糖SEPS 具有一定的抗氧化能力，在抗衰老、抗肿瘤、抗炎症、抗糖尿病活性等方面具有潜在的应用前景[12]。

2.4 胞外多糖SEPS 的吸湿和保湿性能

多糖分子结构中含有大量的羟基、羧基等极性基团，这些极性基团易与水分子形成氢键而结合大量的水分，从而具有良好的吸湿和保湿性。同时，多糖具有良好的成膜性，能够在果蔬、皮肤等表面形成“锁水膜”，防止水分流失，达到持久保鲜或保湿的效果。目前，越来越多的多糖被用于鲜切水果保鲜剂和化妆品保湿剂[19-20]。

2.4.1 吸湿性

分别在相对湿度43%和相对湿度81%环境下，研究了胞外多糖SEPS 的吸湿性，结果见图9 和图10。

图9 SEPS 在相对湿度43%时的吸湿效果Fig.9 Moisture-absorption rates of SEPS at relative humidity of 43%

图10 SEPS 在相对湿度81%时的吸湿效果Fig.10 Moisture-absorption rates of SEPS at relative humidity of 81%

由图9 和图10 可知，在相对湿度43%和相对湿度81%环境下，胞外多糖SEPS 及常用保湿剂甘油和海藻酸钠的吸湿率在24 h 内均不断升高，且环境湿度越大，吸湿性越强；相对湿度81%环境下，甘油的吸湿性最强，24 h 吸湿率为95.5%，明显高于海藻酸钠（45.1%）和胞外多糖SEPS（63.3%）。刘恕[21]的研究也同样显示了甘油优越的吸湿性能，其在不同湿度条件下的吸湿率优于聚乙二醇、透明质酸等其它常用保湿剂。然而，胞外多糖SEPS 在24 h 内的吸湿率明显高于海藻酸钠，表明胞外多糖SEPS 具有良好的吸湿性能。

2.4.2 保湿性

在干燥硅胶环境（相对湿度0%）中，研究了胞外多糖SEPS 的保湿性，结果见图11。

图11 SEPS 在干燥硅胶环境中的保湿效果Fig.11 Moisture-retention rates of SEPS under dry silica gel condition

由图11 可知，在干燥环境下，胞外多糖SEPS 与常见保湿剂甘油和海藻酸钠的水分变化趋势一致，在12 h 内快速下降，之后随着时间的延长，水分的散失开始变得缓慢；胞外多糖SEPS 保湿效果优于甘油和海藻酸钠，36 h 时胞外多糖SEPS、海藻酸钠和甘油保湿率分别为31.6%、27.8%和20.0%。

3 结论

血耳伴生菌菌株韧革菌XE02 产生胞外多糖的最佳培养基为大米培养基，在30 ℃、200 r/min 条件下培养7 d，发酵液离心上清中胞外多糖含量为（1.62±0.05）g/L，经H2O2脱色、Sevag 试剂脱蛋白和乙醇沉淀制备得到胞外粗多糖，得率为（1.1±0.2）g/L。采用DEAE-52 纤维素柱层析对粗多糖进行纯化，得到1 个中性多糖组分SEPS，其冷冻干燥后为蓬松的白色絮状物，在透射电镜下的分子形貌呈长丝状。高效凝胶渗透色谱分析表明，SEPS 为复合多糖，含有SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3 共3 种多糖组分，相对分子质量分别为3.77×103、19.61、1.87 kDa。傅里叶变换红外光谱分析表明，SEPS 具备多糖类物质的一般结构特征，其单糖组成为吡喃糖，含有β-构型糖苷键和α-构型糖苷键。

SEPS 具有良好的羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力，且呈剂量依赖性。在10 mg/mL 时，SEPS 的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除率分别约为68%和74%。SEPS 具有良好的吸湿、保湿性能。在相对湿度43%和81%环境下，SEPS 的吸湿效果不及甘油，但明显高于海藻酸钠，在相对湿度81%下，24 h 时SEPS、海藻酸钠和甘油的吸湿率分别为63.3%、45.1%和95.5%；在相对湿度为0%的干燥环境下，SEPS 保湿效果优于甘油和海藻酸钠，36 h 时SEPS、海藻酸钠和甘油保湿率分别为31.6%、27.8%和20.0%。该结果表明，SEPS在保健食品、果蔬保鲜、化妆品等领域具有较好的开发应用潜力。