冷激复合柚皮提取物处理对鲜切马铃薯褐变调控的影响

李明，王艳瑜，焦玉珍，刘雨涵，乔丽萍，2*，刘霞

（1.天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457；2.天津捷盛东辉保鲜科技有限公司，天津 300300）

鲜切果蔬，又称最小加工果蔬，具有新鲜、营养、方便等特点，市场发展前景广阔[1]。然而，加工过程中的削皮及切割机械损伤，使鲜切产品更易受微生物侵染，发生失水、软化、异味等问题，影响产品货架期[2]。此外，酶促褐变也是鲜切果蔬产业的发展瓶颈[3]，其本质是酚类物质在多酚氧化酶和过氧化物酶的催化作用下生成醌类物质，进而导致类黑素在其表面发生积累[4]。

目前，鲜切果蔬制品的保鲜方法主要为物理、化学和生物方法。其中，常见物理方法包括气调、低温、热处理和非热技术等；化学方法通常为化学保鲜剂和可食性涂膜的应用；常见的生物方法为使用拮抗菌[5]。然而，这些常用方法在安全性、经济成本方面均存在一定局限性。因此，探寻一种可操作性强、安全性高、成本低、有效的褐变防控保鲜方法具有重要意义。

冷激处理是一种将果蔬进行短时低温处理，通过冷胁迫作用诱导果蔬提高自身的生理抗性，从而延长贮藏期和提高贮藏品质的物理方法，其中，常用方法为冰水混合物冷激和冷空气冷激[6]。冷激处理操作简便、安全性高、能耗低，具有广阔的应用前景[7]。张婷婷等[8]采用0 ℃冰水混合物冷激处理茄子，维持了茄子果实的活性氧和抗氧化代谢平衡，减少了膜脂氧化损伤，进而减轻冷害症状，延缓了果肉的褐变。研究表明，冷激处理可以通过减少活性氧的积累，提高抗氧化能力来降低香蕉[9]、杨桃[10]冷害指数，保持果实的良好贮藏品质。目前，冷激处理在果蔬保鲜领域中已有相关应用，然而其在鲜切马铃薯褐变防控方面的应用及相关作用机制鲜有报道。

植物提取物具有天然环保、安全高效的特点，近年来在果蔬保鲜和贮藏品质控制方面具有很高的应用价值[11]。柚子是深受人们喜爱的水果之一，盛产于湖南、福建、广东等地。柚皮营养成分丰富，含有精油、柠檬苦素、黄酮类等多种生理活性物质，具有抗菌、抗氧化功能和药用价值[12]。目前，柚皮提取物在鲜切果蔬的保鲜应用方面鲜见报道，充分开发利用柚皮这一加工废弃物中的活性物质，对减少资源浪费、提升经济效益具有重要意义。

本文以马铃薯为试验材料，探究冷激处理、柚皮提取物处理、冷激复合柚皮提取物处理对鲜切马铃薯贮藏期间的色泽品质、褐变反应关键酶活、膜脂过氧化物质的积累和抗氧化能力等方面的调控规律，系统评价上述3 种不同处理方式对鲜切马铃薯的护色效果，以期为鲜切果蔬的褐变控制开发一种简单、安全、有效的保鲜方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜马铃薯（荷兰15 号）：市售；柚皮提取物（水提物，浓缩比20∶1）：陕西绿晟源生物制品制造有限公司；聚乙二醇、交联聚乙烯吡咯烷酮、邻苯二酚、愈创木酚、乙二胺四乙酸、L-苯丙氨酸、福林酚试剂、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、无水乙醇（均为分析纯）：天津市百奥泰科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

WG-0218 型精密色差仪：东莞七彩仪器设备有限公司；EPOCH 型酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；TGL-16M 型冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；HB-458350 型电热恒温水浴锅：欧莱德科学仪器（北京）有限公司。

1.3 处理方法

洗净的新鲜马铃薯随机分为两批，其中一批作冷激预处理：将马铃薯整果置于（2±1）℃冰水混合物中冷激25 min；另一批不做任何处理。

对照组（CK）：将未处理的马铃薯去皮、切片（5 mm）置于清水中备用。冷激处理组（CS）：做冷激预处理后的马铃薯整果去皮、切片（5 mm）置于清水中。柚皮提取物处理组（PP）：将未处理的马铃薯去皮、切片（5 mm）后置于0.05%柚皮提取物溶液（0.5 g/L）浸泡5 min。冷激复合柚皮提取物处理组（CS+PP）：做冷激预处理后的马铃薯整果去皮、切片（5 mm）后置于0.05%柚子皮提取物溶液中浸泡5 min。

使用无菌纱布蘸干鲜切马铃薯样品的表面水分后，将其分装于PE 自封袋中密封并作好标记，置于4 ℃冷藏8 d，每隔2 d 测定相应的试验指标。

1.4 试验指标测定

1.4.1 样品色泽的测定

鲜切马铃薯的色泽使用精密色差仪进行测定[1]，测定数据分别表示为L*值（亮度值）、a*值（红绿值）、b*值（黄蓝值），L*值越大亮度越大。将样品的褐变程度表示为ΔE 值（总色差值），ΔE 值越大，褐变程度越大。ΔE 计算公式如下。

1.4.2 关键酶活性的测定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性测定参照曹建康等[13]的方法。

2 g 马铃薯样品在5.0 mL PAL 提取缓冲液中研磨，浆液于4 ℃下离心30 min（10 000 r/min），收集上清液用于PAL 活性测定。PAL 活性测定反应试管中加入3 mL 50 mmol/L 的硼酸缓冲溶液和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯丙氨酸溶液后，37 ℃水浴10 min。水浴完毕，上述反应管中加入0.5 mL 粗酶提取液，混匀后迅速测定反应混合液在290 nm 处的初始吸光值。随后再次将反应管置于37 ℃水浴中保温60 min，并测定反应混合物的最终吸光值。将每克马铃薯样品（鲜重）每小时吸光值增加0.01 表示为1 个PAL 活力单位（U/g）。

2 g 马铃薯样品在5.0 mL 提取缓冲液中研磨成浆，随后在4 ℃条件下离心30 min（10 000 r/min），收集上清液为粗酶提取液，用于PPO、POD 活力的测定。

PPO 活性测定反应体系由4.0 mL 乙酸缓冲溶液（50 mmol/L、pH5.5）、1 mL 邻苯二酚溶液（50 mmol/L）、0.1 mL 粗提液组成。反应液混匀后，迅速测定其在420 nm 处的初始吸光值，随后间隔1 min 记录1 次，连续记录时长6 min。以每克马铃薯样品（鲜重）每分钟吸光值变化增加1 为1 个PPO 活力单位（U/g）。

POD 的活性测定反应体系由3.0 mL 愈创木酚溶液（25 mmol/L）、0.5 mL 粗酶液以及0.2 mL 过氧化氢溶液（0.5 mol/L）构成，其中，过氧化氢溶液为反应启动液，最后加至测定反应管中。反应启动后，迅速记录反应混合液于波长470 nm 处的初始吸光值，随后每间隔30 s 记录一次，记录时长3 min。以每克马铃薯样品（鲜重）每分钟吸光值变化增加1 为1 个PPO 活力单位（U/g）。

1.4.3 总酚含量的测定

总酚含量的测定采用福林酚法[14]。称取马铃薯样片2 g，加入5 mL 60%乙醇溶液于冰浴中研磨匀浆，4 ℃下离心10 min（10 000 r/min）并收集上清液。反应管中依次加入0.25 mL 酶提取液（上清液）、2 mL 蒸馏水、0.8 mL 20% Na2CO3溶液和0.25 mL 福林酚试剂并混合均匀，置于暗处反应25 min 后测定反应混合物于760 nm 处的吸光值。以每克新鲜马铃薯所含没食子酸当量计算总酚含量，单位为mg/g。

1.4.4 丙二醛含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定参考Hassan 等[15]的方法。1 g 马铃薯样品在5.0 mL 三氯乙酸溶液（100 g/L）中研磨，4 ℃下离心20 min（10 000 r/min），收集上清液。反应试管中加入2.0 mL 上清液和2.0 mL硫代巴比妥酸溶液（0.67%）并充分混匀，煮沸20 min，待冷却至室温后，4 ℃下离心20 min（10 000 r/min）。测定反应混合物450、532、600 nm 处的吸光值，MDA 含量测定结果表示为μmol/kg。MDA 含量计算公式如下。

式中：c 为丙二醛浓度，μmol/L；V 为提取液总体积，mL；Vs为测定时所加的样液体积，mL；m 为马铃薯样品质量，g；X 为丙二醛含量，μmol/kg；A 为OD532；B为OD600；D 为OD450。

1.4.5 H2O2含量的测定

H2O2含量的测定参考Patterson 等[16]的方法。2 g 马铃薯样品在5.0 mL 预冷的丙酮中研磨，4 ℃下离心20 min（10 000 r/min），收集上清液。反应试管中加入1.0 mL 上清液、0.2 mL 10%四氯化钛-盐酸溶液和0.2 mL 浓氨水，混匀、反应5 min 后，离心15 min（10 000 r/min），收集沉淀。使用3.0 mL 2 mmol/L 硫酸将经预冷丙酮洗去色素后的沉淀充分溶解，测定混合液在412 nm 处的吸光值，H2O2含量测定结果表示为μmol/g。H2O2含量计算公式如下。

式中：X 为过氧化氢含量，μmol/g；n 为标准曲线对应的过氧化氢物质的量，μmol；V 为提取液总体积，mL；Vs为测定时样液体积，mL；m 为样品质量，g。

1.4.6 DPPH 自由基清除率的测定

DPPH 自由基清除率的测定参考Zheng 等[17]的方法。马铃薯样品充分研磨后取适量汁液于4 ℃离心10 min（10 000 r/min），取上清液。0.2 mL 2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液（257.7 mg/L）和0.5 mL 95%乙醇、2 mL 95%乙醇和0.5 mL 上清液、2 mL DPPH 溶液和0.5 mL 上清液分别反应30 min 后，在517 nm 测定混合溶液的吸光值，并依次记录为A0、Ar、As。DPPH 自由基清除率（X，%）计算公式如下。

1.4.7 谷胱甘肽含量的测定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的测定参考Su等[18]的方法。在预冷的50 g/L 三氯乙酸溶液（含50 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠）中研磨马铃薯样品，收集上清液。两根反应管中加入1.0 mL 上清液和1.0 mL 磷酸缓冲液（0.1 mol/L、pH7.7）后，其中一根管中加入0.5 mL 二硫代硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，DTNB）溶液（4 mmol/L），另一根管中加入0.5 mL 磷酸缓冲液（0.1 mol/L、pH6.8），混合均匀后置于25 ℃反应10 min。反应结束后，测定混合溶液于412 nm 处的吸光值，分别记作OD0、ODS，GSH 含量测定结果表示为μmol/g。GSH 含量计算公式如下。

式中：X 为谷胱甘肽含量，μmol/g；n 为标准曲线对应的谷胱甘肽物质的量，μmol；V 为提取液总体积，mL；Vs为测定时样液体积，mL；m 为样品质量，g。

1.5 数据处理

所有试验数据均重复测定3 次，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS Statistics 26 软件对试验数据进行单因素ANOVA 检验，P＜0.05 为差异显著。采用Origin 2022 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对鲜切马铃薯色泽品质的影响

色泽是最能反映鲜切果蔬褐变程度的直观指标。单一柚皮提取物处理、冷激处理和冷激复合柚皮提取物处理对鲜切马铃薯色泽品质的影响如图1 所示。

由图1 可以看出，随着贮藏时间的延长，鲜切马铃薯的表观色泽逐渐加深，L*值呈下降趋势。贮藏8 d 后，样品未出现腐烂现象，对照组的样品表观褐变严重，各试验处理组样品表面褐变程度轻微且维持较高的L*值，其中，冷激复合柚皮提取物处理组的亮度值最大，褐变现象明显轻于单一处理组。贮藏期间，样品的a*值逐渐增大。其中，相比于对照组，处理组维持了较低的a*值，说明各试验处理组可能减少了样品表面红褐色物质的积累，减轻了褐变症状。与对照组相比，各处理组的样品ΔE 值在整个贮藏期间趋于缓慢变化，在贮藏后期6 d 和8 d 时，冷激复合柚皮处理组样品维持了最低的ΔE 值。综合分析可知，柚皮处理、冷激复合柚皮处理均能对鲜切马铃薯起到不同程度的护色作用，效果由强到弱依次为冷激复合柚皮处理＞柚皮处理＞冷激处理＞对照组。

2.2 不同处理方式对鲜切马铃薯PPO、POD、PAL 活性及总酚含量的影响

不同处理方式对鲜切马铃薯PPO、POD、PAL 活性及总酚含量的影响见图2。

图2 不同处理方式对鲜切马铃薯贮藏期间PPO、POD、PAL 活性和总酚含量的影响Fig.2 Effects of different treatment methods on PPO，POD，PAL activity and total phenolic content of fresh-cut potato during storage

PPO 和POD 是鲜切果蔬酶促褐变反应中的关键酶，能将果蔬中的酚类底物氧化生成醌类，进而形成褐色物质[19]。由图2 可知，鲜切马铃薯的PPO 活性在贮藏期间呈上升趋势，且各试验处理组的PPO 活性始终低于对照组水平（P＜0.05），其中，柚皮提取物处理组和冷激复合柚皮处理PPO 酶活始终显著低于冷激处理组（P＜0.05）。在贮藏8 d 时，冷激复合柚皮提取物处理组的PPO 活性水平最低，比对照组6 d 时的PPO 活性低18.5%。

鲜切马铃薯的POD 活性呈增长趋势，与对照组相比，各处理组均维持了较低的POD 活性水平。柚皮提取物处理组和冷激复合柚皮提取物处理较冷激处理组更能抑制POD 酶活，且两组的POD 酶活表现为始终低于冷激处理组，除了6 d 时冷激复合柚皮处理组的POD 酶活低于柚皮处理组外，两处理组间POD 酶活无显著差异。

PAL 是酚代谢的限速酶，能够催化L-苯丙氨酸生成酚类物质，在植物细胞受到环境中的不良胁迫时，PAL 活性随之升高，进而增加褐变底物酚类物质的浓度[20]。由图2 可知，鲜切马铃薯样品的PAL 活性总体呈先上升后下降的趋势。这可能是因为机体受到机械损伤的胁迫，进而导致PAL 活性迅速上升，在贮藏2 d时，各组的PAL 活性均达到峰值，且各试验处理组的峰值均显著低于对照组（P＜0.05）。冷激复合柚皮提取物处理组始终维持鲜切马铃薯贮藏期间PAL 活性的最低水平，其PAL 活性抑制效果较单一处理好。8 d时，冷激复合柚皮提取物处理组的PAL 活性约为对照组的60%。

酚类化合物是酶促褐变的主要底物，酚类底物的积累会加速鲜切果蔬的酶促褐变进程。总酚含量整体呈上升的趋势，柚皮提取物处理和冷激复合柚皮提取物处理组的总酚含量在贮藏期间始终显著低于对照组（P＜0.05），冷激处理组在4 d 和6 d 时显著低于对照组的总酚水平（P＜0.05）。贮藏8 d 后，冷激复合柚皮提取物处理组的总酚含量最低。

上述结果表明，柚皮处理、冷激处理、冷激复合柚皮处理均能不同程度抑制PPO、POD、PAL 活性，减少总酚含量的积累，综合分析可知，冷激复合柚皮提取物处理效果最好。

2.3 不同处理方式对鲜切马铃薯MDA 和H2O2 含量的影响

不同处理方式对鲜切马铃薯MDA 和H2O2含量的影响见图3。

图3 不同处理方式对鲜切马铃薯贮藏期间MDA 和H2O2 含量的影响Fig.3 Effects of different treatment methods on MDA and H2O2 content of fresh-cut potato during storage

MDA 是膜脂过氧化的主要产物，是衡量细胞膜完整性的重要指标，MDA 含量越高，细胞膜的损伤程度越大[21]。由图3 可知，MDA 含量随着贮藏时间的延长呈增加趋势，各试验处理组样品的MDA 含量水平始终低于对照组（P＜0.05）。说明柚皮提取物处理、冷激处理、冷激复合柚皮提取物处理能有效减小鲜切马铃薯的细胞膜损伤程度。在贮藏8 d 后，冷激复合柚皮提取物处理组的MDA 水平最低，比对照组MDA 含量低17%，说明复合处理比其他处理更能有效维持样品细胞膜的完整性。

果蔬在受到机械损伤后能引起活性氧的迅速积累，并作为一种信号分子参与逆境响应，但过量的活性氧能促进氧化损伤，加速酶促褐变进程[22-23]。H2O2是具代表性的活性氧种类之一，贮藏期间样品的H2O2含量呈先上升后下降的趋势，相较对照组，各试验处理组能在不同程度减少H2O2的积累。贮藏8 d 时，各试验处理组H2O2含量均显著低于对照组（P＜0.05），其中冷激复合柚皮提取物处理组的H2O2水平最低，柚皮提取物处理和冷激处理组间H2O2含量无显著差异。表明冷激复合柚皮提取物处理能有效减少活性氧的积累，有助于减轻鲜切马铃薯褐变程度。

2.4 不同处理方式对鲜切马铃薯DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影响

不同处理方式对鲜切马铃薯DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影响见图4。

图4 不同处理方式对鲜切马铃薯贮藏期间DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影响Fig.4 Effects of different treatment methods on DPPH radicals scavenging capacity and GSH content of fresh-cut potato during storage

通常情况下，果蔬的抗氧化能力可以使用DPPH自由基清除率来评价[24]。如图4 所示，鲜切马铃薯的DPPH 自由基清除率呈先上升后下降的趋势，柚皮提取物处理组、冷激处理组、冷激复合柚皮提取物处理组不同程度提高了DPPH 自由基清除率。其中，各试验处理组中，复合处理组的DPPH 自由基清除率在贮藏期间始终显著高于对照组（P＜0.05）。表明冷激复合柚皮提取物处理能有效提高鲜切马铃薯的抗氧化能力，进而减少氧化损伤。

GSH 是果蔬的抗氧化体系抗坏血酸-谷胱甘肽循环中一种重要的抗氧化物质，能将脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA）还原成抗坏血酸，在维持活性氧平衡、提高抗氧化能力、减轻酶促褐变等方面发挥重要作用[25-26]。由图4 可知，单一处理和复合处理显著提高了鲜切马铃薯的GSH 含量，除6 d 外，冷激复合柚皮提取物处理均维持了GSH 含量的最高水平。4 d时，各组的GSH 含量达到峰值，复合处理组的峰值比对照组高32%，贮藏8 d 时，复合处理组GSH 含量较对照组高14%。表明冷激复合柚皮提取物处理能维持样品中较高的GSH 水平，有助于维持氧化还原平衡，减轻鲜切马铃薯的褐变症状。

3 结论

本研究探究柚皮提取物处理、冷激处理、冷激复合柚皮提取物处理对鲜切马铃薯的护色效果以及褐变反应关键酶活力、总酚含量、活性氧积累、抗氧化能力的变化规律。结果表明，与对照组相比，柚皮提取物处理、冷激处理、冷激复合柚皮提取物均在不同程度上有效提高了鲜切马铃薯的抗氧化能力，减轻了鲜切马铃薯的褐变症状，其中，冷激复合柚皮提取物处理的护色效果最佳。冷激复合柚皮提取物更好地维持了鲜切马铃薯的原有色泽，延缓了鲜切马铃薯的L*值的下降、a*值和总色差ΔE 值的增大，降低了PPO、POD、PAL 的活性和总酚含量，减少了MDA 和H2O2的积累，提高了DPPH 自由清除率和GSH 水平，在维持氧化还原平衡、减少膜脂氧化损伤和延缓鲜切马铃薯贮藏期间的褐变进程方面表现出明显的优势。因此，本研究为鲜切果蔬的褐变防控提供了一种简单、安全、有效的保鲜方法和相应的理论参考依据，对合理利用柚皮的活性物质、减少资源浪费、提升经济效益具有现实意义。