茄子Ⅳ型查尔酮异构酶基因SmCHI2的克隆与分析

2023-09-12崔群香刘同金班秋妍袁颖辉范俊俊沈慧玲

西南农业学报 2023年7期

周露,崔群香,刘同金,班秋妍,袁颖辉,宁坤,范俊俊,张敏,沈慧玲

(金陵科技学院园艺园林学院,南京 210038)

【研究意义】茄子(SolanummelongenaL.)属茄科茄属,因其种植适应范围广且产量高,在蔬菜生产中占据重要地位。紫色茄子果皮中含有丰富的类黄酮化合物-花青素。花青素作为一种水溶性的植物色素,它可以赋予植物丰富的颜色。此外,花青素具有吸引昆虫传粉,保护植物免受病原微生物侵染等生物学功能[1-2]。同时,花青素还能有效降低患冠心病、中风和癌症的风险[3]。花青素因在植物生理和人类健康上具有上述功能而使其备受关注。查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)作为花青素生物合成途径中的关键酶,探究其蛋白信息及表达特性对完善茄子花青素生物合成调控具有重要作用。【前人研究进展】在类黄酮合成途径中,查尔酮异构酶可催化黄色查尔酮形成无色柚皮素。根据功能和同源关系可将其分为4个亚家族(I型、II型、III型和IV型)[4],其中I型和II型CHI具有CHI酶催化活性,可通过催化查尔酮分子内环化反应形成类黄酮及异黄酮等[5],而III型和IV型CHI则不具备查尔酮环化活性[6]。虽然IV型缺乏CHI环化活性,但它仍可促进植物中类黄酮化合物的产生[7-9]。目前研究者已从康乃馨[10]、烟草[11]、苹果[12]、茄子[13]等多种植物中克隆获得查尔酮异构酶基因。相比黄果草莓,红果草莓中FaCHI基因表达上调,且其表达量与花青素含量呈正相关[14]。在海南龙血树和烟草中过表达DcCHI1基因和DcCHI4基因可增加类黄酮积累[15]。在拟南芥中异源表达茄子SmCHI基因可显著增加转基因植株的花青素含量[13]。【本研究切入点】近年来,关于茄子花青素生物合成调控已取得一些研究进展,包括SmCHS、SmCHI、SmF3H和SmDFR[13]等结构基因以及SmMYB113[16]、SmMYB75[17]、SmMYB86[18]等调节基因在花青素合成途径中的功能已被验证。然而,部分结构基因在茄子中存在多个同源基因,通过探究这些基因的功能,有助于筛选与之结合的调控基因,从而进一步完善茄子花青素合成调控网络。【拟解决的关键问题】本研究在茄子中克隆获得另一个CHI同源基因SmCHI2,通过分析其蛋白水平(理化性质、蛋白结构、序列比对、进化树分析和亚细胞定位)和表达水平(基于qRT-PCR的组织特异性表达分析),为研究CHI基因功能,完善茄子花青素生物合成途径和品质育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

种植于南京市金陵科技学院幕府校区园艺站的紫长型茄子栽培种。采集根、茎、叶、果肉、花瓣、萼片、紫色果皮以及套袋处理后的白色果皮,液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中,用于RNA提取。

1.2 茄子总RNA提取及SmCHI2基因的克隆

利用植物总RNA提取试剂盒(诺唯赞,南京)提取茄子紫色果皮RNA,随后采用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA,北京)将RNA反转录为cDNA。利用茄子基因组数据库(https://solgenomics.net/和http://eggplant.kazusa.or.jp/)BLAST程序查找茄子中CHI蛋白的同源基因并将其命名为SmCHI2。使用Primer Premier 6软件设计SmCHI2基因的特异引物SmCHI2-F/R(表1)。以上述cDNA为模板,扩增获得SmCHI2基因序列。

PCR反应液体系包括1 μL cDNA模板、25 μL PrimeSTAR Max Premix酶、10 μmol/L正反引物各1 μL及22 μL ddH2O。PCR反应程序为98 ℃变性10 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s,35个循环。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,利用凝胶回收试剂盒(诺唯赞,南京)获得目的片段,将其连接到pEASY-Blunt克隆载体(全式金,北京)上后转入大肠杆菌感受态细胞中,挑选PCR检测阳性的单克隆送至生物公司(生工,上海)进行测序,获得Blunt-SmCHI2重组载体,并利用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取。

1.3 茄子SmCHI2基因的生物信息学分析

使用Prot Param tool 网站分析编码蛋白的理论等电点、分子量、蛋白质水溶性等;利用在线网站SOPMA分析蛋白质的二级结构;通过SWISS MODEL在线网站预测蛋白质三级结构;利用ClustalX 1.7和GeneDoc 2.7.0软件进行蛋白序列比对;利用ClustalX 1.7和Mega 6.0软件进行蛋白进化树分析。

表1 本研究所用引物

1.4 茄子SmCHI2蛋白的亚细胞定位

以上述Blunt-SmCHI2质粒为模板,设计PHB-SmCHI2-F/R引物(表1)扩增SmCHI2的CDS片段,利用TAKARA公司的In-Fusion HD Cloning Plus同源重组酶将其构建至含有黄色荧光蛋白的植物表达载体PHB-YFP上,测序正确后获得重组载体PHB-SmCHI2-YFP。将其转化至GV3101农杆菌菌株中,随后接种于含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中,28 ℃过夜培养使其D600达到0.6～0.8,离心后去上清,并使用悬浮液(含有蔗糖、乙酰丁香酮和MES的MS液体培养基)进行重悬,静置2～3 h后注射至本氏烟草的叶片背面。利用尼康激光共聚焦显微镜检测YFP蛋白的荧光信号。

1.5 茄子SmCHI2基因的表达模式分析

提取光敏型紫茄的根、茎、叶、花瓣、萼片、果肉、紫色果皮、遮光后白色果皮的总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板进行qRT-PCR测定。以SmAPRT为内参,设计qRT-PCR引物(表1)。参照TB Green Premix ExTaqTMⅡ(TAKARA,北京)说明书,使用20 μL体系在ABI7500荧光定量PCR检测仪上进行相对表达量的检测,每个组织进行3次生物学重复和技术重复。采用2-ΔΔCt方法计算得到基因相对于内参的表达水平。根据已发表的茄子转录组数据[19],分析光敏型和非光敏型紫茄在套袋-光照处理0、0.5、4.0和8.0 h后SmCHI2基因的表达情况。

2 结果与分析

2.1 茄子SmCHI2基因的克隆

利用茄子基因组数据库(https://solgenomics.net/和http://eggplant.kazusa.or.jp/)中BLAST程序查找茄子中CHI蛋白的同源基因。Jiang等[13]已报道一个位于茄子第10号染色体上的SmCHI基因(SMEL4.1_10g016630.1),本研究克隆获得位于第5号染色体上的一个CHI同源基因,将其命名为SmCHI2(SMEL4.1_05g001480.1)。通过PCR扩增技术进行SmCHI2基因扩增(图1),将其连接到克隆载体pEASY-Blunt上,测序后获得全长633 bp的SmCHI2基因CDS序列(图2),将其上传至NCBI数据库,获得GenBank登录号ON911770,说明成功克隆了茄子SmCHI2基因。

2.2 茄子SmCHI2蛋白的特性分析

使用ExPASY在线工具将SmCHI2基因序列翻译成蛋白序列,其共编码210个氨基酸(图3),其中谷氨酸(Glu,E)的含量最高,占12.4%。利用在线软件对SmCHI2蛋白进行生物信息学分析,该蛋白质分子式为C1083H1689N269O330S7,相对分子质量为23.98 kDa,理论等电点为4.81,不稳定系数(II)为44.81,属不稳定蛋白,脂溶指数为90.84,总亲水性平均系数为-0.260,为亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示该蛋白位于细胞质中的概率最大,为45%,说明SmCHI2蛋白主要定位于细胞质中。

M: DL 2000;1: PCR扩增产物。

图2 茄子SmCHI2基因的CDS序列

图3 茄子的SmCHI2氨基酸序列

使用SOPMA软件预测SmCHI2蛋白的二级结构(图4),其二级结构中α-螺旋占比最大,为45.24%,其次为随机卷曲,占26.67%,延伸链占22.38%,β-转角占5.71%。说明SmCHI2蛋白的二级结构由α-螺旋、随机卷曲、延伸链和β-转角构成。以拟南芥AtCHI晶体结构为模板,利用SWISS-MODEL在线分析工具对茄子SmCHI2蛋白的三级结构进行建模预测,结果显示,SmCHI2与AtCHI蛋白一致性为65.2%,主要结构为α-螺旋(图5)。说明三级结构与二级结构的预测相符。

2.3 茄子SmCHI2蛋白的序列同源性和系统进化树分析

对茄子、葡萄、苹果、甜橙、草莓、大豆、辣椒等17种植物的CHI蛋白构建系统进化树。由图6可知,茄子SmCHI2属于Ⅳ型CHI蛋白,且与LcCHI(枸杞AIC33515.1)、LrCHI蛋白(黑枸杞AQZ26680.1)、CaCHI2(辣椒XP_016573438.1)和StCHI3蛋白(马铃薯XP_006365329.1)等属于同一分支,亲缘关系较近。而与AtCHI3(拟南芥AAM61303.1)、GmCHI3(大豆AAT94361.1)和SlCHI3(番茄AAQ55182.1)等Ⅲ型蛋白同源关系较远。

序列比对显示,SmCHI2与Ⅳ型CHI蛋白StCHI3(马铃薯XP_006365329.1)、CaCHI2(辣椒XP_016573438.1)、LcCHI(枸杞AIC33515.1)、LrCHI(黑枸杞AQZ26680.1)和PdCHI2(滇牡丹QDZ06023.1)具有相同的活性位点和识别位点(图7)。说明CHI蛋白在物种间高度保守。

图4 蛋白质二级结构预测

图5 茄子SmCHI2蛋白三级结构预测

Sm:茄子;Lc:枸杞;Lr:黑枸杞;Ca:辣椒;St:马铃薯;Pd:滇牡丹;Cs:甜橙;Fa:草莓;Vv:葡萄;At:拟南芥;Ac:洋葱;Ch:陆地棉;Zm:玉米;Lj:百脉根;Gm:大豆;Ms:紫花苜蓿;Pl:葛根;Sl:番茄;Dc:海南龙血树;下同。SmCHI:ANN02871.1;LcCHI:AIC33515.1;LrCHI: AQZ26680.1;CaCHI2: XP_016573438.1;StCHI3: XP_006365329.1;PdCHI1: QDZ06022.1;PdCHI2: QDZ060 23.1;CsCHI:BAA36552.1;FaCHI1:Q4AE11.1;VvCHI1:P51117.1;AtCHI:P41088.2;AtCHI3:AAM61303.1;AtCHIL: NP_568154.1;AcCHI: AAU11843.1;ChCHI:ABM64798.1;ZmCHI: CAA80441.1;ZmCHIL: NP_001151452.1;LjCHI: CAD69022.1;LjCHI2:Q8H0G1.1;GmCHI1A:AAT94358.1;GmCHI1B1:AAT943 59.1;GmCHI2:AAT94360.1;GmCHI3:AAT94361.1;GmCHI4:AAT94362.1;MsCHI1: P28012.1;PlCHI: Q43056.1;SlCHI3: AAQ55182.1;DcCHI4: QTF65959.1;DcCHI5: QTF65960.1。

红框表示Ⅳ型CHI蛋白识别位点。

图8 茄子SmCHI2蛋白的亚细胞定位

2.4 茄子 SmCHI2蛋白的亚细胞定位

为了明确SmCHI2蛋白的亚细胞定位,构建融合蛋白PHB-SmCHI2-YFP,在本氏烟草叶片中进行瞬时表达。结果显示,SmCHI2蛋白定位于细胞核、细胞膜和细胞质中(图8)。

2.5 茄子SmCHI2基因的表达模式分析

如图9所示,虽然SmCHI2基因在各组织中均有表达,但主要在紫色组织,包括叶、花瓣、萼片和紫色果皮中表达。相对于套袋遮光后的白色果皮,SmCHI2基因在紫色果皮中表达显著增加。说明SmCHI2基因参与茄子花青素的生物合成。

为了进一步探究光照对SmCHI2基因表达和茄子花青素生物合成的影响,对已有的茄子转录组数据[19]进行分析,依据SmCHI和SmCHI2基因表达情况绘制热图(图10)。对光敏型(PS)和非光敏型(NPS)茄子果实进行套袋-开袋处理0、0.5、4.0和8.0 h,结果表明,2个SmCHIs基因表达趋势基本一致,光照可以促进光敏型茄子中SmCHI2基因的表达,对非光敏型茄子中SmCHI2基因的表达也有一定影响。

3 讨论

本研究从茄子中克隆获得位于第5号染色体上CHI同源基因SmCHI2,其CDS全长633 bp,编码210个氨基酸,分子量为23.98 kDa,理论等电点为4.81,不稳定系数(II)为44.81,是不稳定蛋白,总亲水性平均系数为-0.260,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测其位于细胞质中。二级和三级结构预测显示SmCHI2蛋白结构主要包括α-螺旋、随机卷曲、延伸链和β-转角。序列比对和进化树分析表明SmCHI2蛋白与枸杞AIC33515.1、黑枸杞AQZ26680.1、辣椒XP_016573438.1和马铃薯XP_006365329.1等Ⅳ型CHI蛋白属于同一分支,且具有相同的活性和识别位点。表达分析显示,SmCHI2基因在白色果皮中表达量显著低于紫色果皮,推测其参与茄子花青素的生物合成。

图9 不同组织中SmCHI2基因的相对表达量

图10 SmCHIs基因在光敏和非光敏茄子中表达情况

花青素作为类黄酮代谢途径的主要产物,对植物着色、口感和抗性等具有重要影响。CHI作为花青素合成途径中的关键酶,催化查尔酮转化为黄烷酮[6]。在Del/Ros1过表达番茄中异源表达洋葱CHI基因,可显著增加转基因植株的果皮和果实中花青素含量[20]。在拟南芥tt5突变体中过表达甘薯IbCHI基因可完全互补其着色突变表型,包括种皮、子叶和下胚轴,表明IbCHI蛋白对花青素和原花青素合成具有调节作用[21]。前期研究表明,CHI蛋白可分为I型、II型、III型和IV型,其中IV型CHI蛋白在其催化位点上有几个氨基酸存在替换,因而没有CHI蛋白的催化活性[6]。后期研究表明,IV型CHI蛋白可以作为增强子在类黄酮合成途径中起作用,如拟南芥的CHIL蛋白[22]。在海南龙血树中,IV型CHI蛋白DcCHI4虽然缺乏大多数的关键催化残基,且体外重组DcCHI4不能催化柚皮素查尔酮形成柚皮素,但转录数据表明其可能参与类黄酮积累,且在海南龙血树和烟草中过表达DcCHI4基因可以增加类黄酮合成[15]。序列比对和系统进化树分析表明本研究中的SmCHI2蛋白具有IV型CHI蛋白的保守位点和结合位点,属于IV型CHI蛋白,而前期研究报道的SmCHI蛋白则属于I型CHI,两者同源关系较远,但转录组数据分析表明,两者均受光调控,并且都可能参与茄子花青素的生物合成。表达分析显示,相对于套袋遮光后的白色果皮,SmCHI2基因在紫色果皮和其他紫色组织中表达显著增加,表明SmCHI2基因可能促进茄子花青素的生物合成。关于IV型CHI蛋白参与类黄酮途径的作用机理,研究表明,IV型CHI蛋白似乎可能作为CHI蛋白及查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的激活子与它们进行互作[8, 22]。也有研究者认为,IV型CHI蛋白的作用是促进CHS催化产生2’,4’,4’,6’-四羟基查耳酮,抑制反应过程中副产物4-香豆酰三乙酸内酯的产生,从而促进类黄酮生物合成[9]。

蛋白分析表明茄子SmCHI2蛋白为不稳定蛋白和亲水性蛋白。而芍药CHI蛋白的不稳定指数小于40,总亲水性平均系数为-0.105,为稳定蛋白和亲水性蛋白[23]。滇水金凤中,IuCHI1蛋白不稳定系数为47.57,为不稳定蛋白,而IuCHI2蛋白不稳定系数为39.53,为稳定蛋白[24]。对SmCHI2蛋白的二级结构进行预测发现其主要包含α-螺旋(45.24%)、随机卷曲(26.67%)、延伸链(22.38%)和β-转角(5.71%)。甘草[25]和芍药[23]CHI蛋白质二级结构也含有α-螺旋、随机卷曲、延长链和β-转角结构。亚细胞定位表明,茄子SmCHI2蛋白分布于细胞核、细胞膜和细胞质中,研究者对紫心甘薯查尔酮异构酶进行亚细胞定位也获得相似的结果[26]。本研究通过同源克隆获得茄子SmCHI2基因序列,对其蛋白结构、序列、亚细胞定位以及转录表达水平进行分析,为进一步研究SmCHI2蛋白在花青素合成通路中的的功能和选育富含花青素的茄子新品种提供理论基础。