阿勒泰羊FKBP5基因的克隆及其在组织中的表达

张欣如,吴阳升,汪立芹,陈 莹,古丽米热·阿布都热依木,黄俊成,王旭光,林嘉鹏

(1.新疆农业大学动物科技学院,乌鲁木齐 830091;2.农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室,乌鲁木齐 830011;3.新疆动物生物技术重点实验室,乌鲁木齐 830011)

【研究意义】卵泡是哺乳动物卵巢的基本结构组成和功能单元,卵泡发育是一个复杂的过程,受内分泌、旁分泌和自分泌因子以及卵泡细胞周围环境的调节。同时受多个基因调控,这些基因产物的相互作用可以调节颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵母细胞的发育[1]。【前人研究进展】FKBPs是一种多功能蛋白,也称为FK506结合蛋白,属于免疫亲和蛋白家族成员,在细胞中大量表达并且高度保守。研究发现,FKBPs蛋白不仅在免疫抑制过程中起作用,还调控其它信号转导通路[2]。FKBP5基因也被称为FK506结合蛋白51或FKBP51,编码FKBP5蛋白,目前被研究最多的功能,是其能通过结合其伴侣蛋白Hsp90抑制糖皮质激素受体(GR)的信号传递,从而增加对应激的易感性,已被鉴定为与应激相关的精神疾病(如抑郁症)的候选基因和生物标志物[3-4]。FKBP5参与多种生物过程,包括免疫调节、蛋白质折叠和转运[5-7]作为糖皮质激素受体(GR)复合体的辅助伴侣,FKBP5与热休克蛋白90(Hsp90)[8]。另外,FKBP5蛋白还在代谢调控、癌症发生、细胞增殖及内分泌调控等过程中发挥了重要作用[9-12]。研究发现,牛经过hCG诱导后,其排卵前卵泡颗粒细胞的FKBP5基因表达升高,显著高于小卵泡和优势卵泡的颗粒细胞以及黄体中的表达量[13],提示FKBP5基因可能参与了卵泡的生长发育。新疆畜牧科学院生物技术研究所生殖与调控课题组前期通过转录组分析也发现,羔羊经FSH处理后,其卵泡颗粒细胞中FKBP5基因表达量发生显著变化,FKBP5基因是否与阿勒泰羊颗粒细胞甚至卵泡发育相关,还未有相关报道。【本研究切入点】以新疆阿勒泰羊为研究对象,利用PCR扩增FKBP5CDS区全长并进行测序,同时构建分子系统进化树;分析FKBP5基因或蛋白在阿勒泰羊不同组织和卵泡发育不同时期的表达量变化情况,并对FKBP5蛋白在阿勒泰羊卵巢中的表达进行定位分析,为深入探索FKBP5基因在阿勒泰羊卵泡发育中的作用提供基础试验数据。【拟解决的关键问题】通过对阿勒泰羊不同器官组织、不同发育时期卵泡中FKBP5基因的表达特征进行分析,并对FKBP5蛋白在阿勒泰羊卵巢中的表达进行定位分析,以期为进一步研究其在阿勒泰羊卵泡发育中的生物学功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用阿勒泰羊器官及组织样本均采自乌鲁木齐市华凌屠宰场。分别取3只成年阿勒泰羊个体母羊的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、子宫、卵巢、输卵管,公羊的睾丸等,剪成1 g的小块,放入冻存管中,液氮保存,用于RNA和蛋白提取。挑选有较多卵泡或黄体的完整卵巢放于波恩固定液中固定,用于免疫组化。

将阿勒泰羊卵巢置于装有37 ℃生理盐水的保温杯内,3 h内送回实验室。选取有较多卵泡的卵巢,用小镊子剥下完整卵泡,根据直径大小分为大卵泡(>5 mm)和小卵泡(<3 mm),分别放于生理盐水内。用2个干净的小镊子将卵泡撕开,释放颗粒细胞,并在体视显微镜下捡出卵丘卵母细胞复合体。将大、小卵泡及其颗粒细胞、卵丘细胞和膜细胞分别保存于液氮中,用于定量分析。

1.2 主要试剂

兔多克隆抗体FKBP5一抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司,HRP二抗购自上海碧云天生物技术有限公司,DAB显色液购自北京兰杰柯科技有限公司,BCA试剂盒购自美国Thermo公司,Trizol试剂和普通凝胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物公司,PCR扩增试剂购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司,反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自成都福际生物技术有限公司,DNA Maker和大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术股份有限公司。

1.3 引物设计及合成

引物序列信息如表1所示。

表1 引物序列信息

1.4 试验方法

1.4.1 阿勒泰羊卵巢总RNA的提取及cDNA的合成 使用TRizol法提取阿勒泰羊卵巢组织总RNA,取2 μL RNA置于Nano2000上检测其浓度及纯度,根据浓度值、RNA图谱及OD260mm/OD280mm比值判断RNA的质量。用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,于-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 阿勒泰羊FKBP5基因的克隆及测序 以阿勒泰羊卵巢cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL):模板cDNA 2 μL,上、下游引物各0.5 μL,promega 2×mix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸4 min 30 s,共35个循环;72 ℃延伸5 min;12 ℃保存。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,胶回收,将目的片段连接至T载体上,转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞,在LB固体培养基(Amp+)上涂板,37 ℃恒温培养箱中培养过夜,挑选单克隆PCR菌液验证,阳性克隆送上海生工公司进行测序。

1.4.3 阿勒泰羊FKBP5基因相对表达量的测定 以阿勒泰羊cDNA为模板,阿勒泰羊GAPDH基因为内参进行实时荧光定量Real time-qPCR,反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃ 10 s,引物特异Tm30 s,58 ℃ 30 s,循环40次。熔解曲线分析:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,然后从55 ℃缓慢递增到95 ℃。根据阈值循环(CT)值计算各基因相对于内参基因GAPDH的表达量。每组重复3次。

1.4.4 FKBP5蛋白表达水平的测定 阿勒泰羊组织样品中加入1 mL蛋白裂解液和1%蛋白酶抑制剂,充分匀浆,4 ℃离心,加入蛋白上样缓冲液,煮沸10 min,收集组织总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。每孔加入蛋白在SDS-PAGE凝胶跑电泳,将蛋白转到PVDF膜上,用含有5%脱脂奶粉的TBST液,室温封闭1 h;洗脱封闭液,一抗孵育1 h,洗3次;二抗孵育40 min,洗3次;用ECL显影液[m(A液)∶m(B液)]=1∶1显影,GE6100系统检测化学发光,ImageJ软件分析蛋白灰度值。

1.4.5 阿勒泰羊卵巢免疫组织化学分析 阿勒泰羊卵巢用波恩固定液固定24 h后,换70%酒精保存。常规石蜡包埋,石蜡切片。石蜡切片脱蜡,复水,用蒸馏水浸洗;抗原热修复,PBS洗3次;3% H2O2封闭,PBS洗3次;5% BSA室温封闭1 h;加FKBP5一抗(1∶100),室温孵育90 min,PBS洗3次;加HRP二抗(1∶50),室温孵育40 min,PBS洗3次;加入DAB显色试剂,自来水冲洗;放入苏木素染剂复染,自来水浸洗;盐酸酒精分化,自来水浸洗;脱水/透明,树胶封片。

1.4.6 阿勒泰羊FKBP5氨基酸序列系统进化树分析 根据克隆得到的FKBP5基因序列和从GenBank下载的基因序列分析核酸和氨基酸序列,使用Mega11.0中的邻接法(NJ)构建进化树,不同物种GenBank登录号如表2所示。

1.5 统计分析

使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析,组间差异通过One-way ANOVA多重比较进行方差分析和显著性检验,数据用平均值±标准差表示。

表2 不同物种GenBank登录号

图1 总RNA凝胶电泳

2 结果与分析

2.1 阿勒泰羊总RNA提取质量检测

用1%琼脂糖凝胶电泳检测阿勒泰羊总RNA完整性。从图1可知,28S和18S 2个条带清晰,无拖尾现象,表明提取的总RNA完整性好。采用分光光度计测定RNA浓度,OD260mm/OD280mm在1.8～2.1,表明RNA纯度和浓度较好,可用于后续实验。

1:FKBP5全长片段; M:DNA Marker。

图3 FKBP5基因的核苷酸序列及氨基酸序列

2.2 阿勒泰羊FKBP5 mRNA 序列的克隆及生物信息学分析

以阿勒泰羊卵巢cDNA为模板,用FKBP5基因克隆引物(表1)进行PCR扩增,产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,获得符合预期大小(1532 bp)的目的条带(图2)。将菌液PCR的阳性克隆进行测序鉴定,结果表明,成功克隆阿勒泰羊FKBP5基因1532 bp序列(图3)。

经测序和拼接后,得到1390 bp的FKBP5基因开放阅读框全长,共编码462个氨基酸(图3)。与预测序列(登录号:XM_042237052.1)相比,FKBP5基因的编码区序列完全一致,不存在变异位点。

为了进一步了解绵羊FKBP5基因与其他物种之间的亲缘关系,使用MEGA11.0软件中的NJ法对绵羊、牛、人、鸡、山羊、黑猩猩、小鼠、猪、兔和马等不同物种构建系统进化树。绵羊FKBP5基因与山羊位于同一分支,表明它们之间的亲缘关系较近,而与鸡(禽类)亲缘关系较远(图4)。

2.3 FKBP5基因和蛋白在阿勒泰羊不同器官及组织中的表达分析

利用Real-time qPCR和Western Blot检测阿勒泰羊心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、子宫、卵巢、输卵管和睾丸等9个器官和组织中FKBP5基因和蛋白的表达量。FKBP5基因在各个器官和组织中均有表达,在输卵管中表达量最高,随后依次是肝脏、脾脏、子宫、卵巢和睾丸,在心脏、肺和肾脏中表达量较低(图5-A)。Western Blot结果与定量结果基本一致,阿勒泰羊FKBP5蛋白分子量为51 kD,在阿勒泰羊输卵管中丰度较高,在肺和肾脏等组织中表达量较低(图5-B)。说明FKBP5基因可能与阿勒泰羊生殖有关系。

2.4 阿勒泰羊FKBP5基因和蛋白在卵泡细胞中的表达定位分析

从图6-A可知,阿勒泰羊FKBP5基因在大卵泡中的表达量最高,且极显著高于卵巢、小卵泡和黄体(P<0.01),其次是卵巢和小卵泡,在黄体中表达量最低。

图4 MEGA 11.0 邻接法(NJ)构建进化树

图5 阿勒泰羊不同组织中FKBP5 mRNA水平表达(A)、蛋白表达量及灰度值分析(B)

A:实时定量 PCR 验证 FKBP5 在不同大小卵泡及黄体中的表达,小写字母代表差异显著(P<0.05),大写字母代表差异极显著;B:实时定量 PCR 验证 FKBP5在各卵泡细胞中的表达(GCs,颗粒细胞;CCs,卵丘细胞;Oo,卵母细胞;TCs,膜细胞);不同字母代表差异显著(P<0.05);C～J:免疫组化检测FKBP5在卵泡中的定位表达。C:原始卵泡;D:初级卵泡;E:次级卵泡;F:小有腔卵泡;G:大有腔卵泡;H:大有腔卵泡卵丘卵母细胞复合体;I:黄体;J:阴性对照)。C、D、E标尺为20 μm,F、G、I、J标尺为200 μm,H标尺为50 μm。

从图6-B可知,FKBP5基因在阿勒泰羊卵巢大、小卵泡不同细胞中的表达情况略有不同,在大卵泡膜细胞中的表达极显著高于其他各类细胞(P<0.01),而在大卵泡颗粒细胞中的表达量也显著高于小卵泡的颗粒细胞、膜细胞以及大、小卵泡的卵丘细胞(P<0.05)。FKBP5基因在大卵泡颗粒细胞中表达量最高。说明FKBP5蛋白可能参与卵泡发育,FKBP5蛋白可能促进卵泡进一步发育成优势卵泡。

从图6-C～6-J可知,FKBP5蛋白在初级、次级卵泡和黄体组织中均有表达,在大、小有腔卵泡的卵母细胞、卵丘细胞、颗粒细胞及膜细胞中也有表达。说明FKBP5蛋白可能参与卵泡发育。

3 讨 论

FKBP5蛋白在药物抵抗、免疫及治疗癌症等方面的研究较多[14-16]。近年来,猪、鸡、鸭等畜禽的FKBP5基因已被陆续克隆,且在猪T淋巴细胞增殖和鸭成肌细胞增殖分化中进行了相对深入的功能研究[17-18]。但关于FKBP5 蛋白参与阿勒泰羊繁殖相关过程上的研究还未见报道。本研究发现,FKBP5蛋白与其他物种有较高的同源性,这将为在后续研究中将其广泛应用于不同物种奠定基础。

FKBP5基因在人体基因中广泛表达,在心脏、肝脏、肾脏、外周淋巴细胞、卵巢、睾丸等器官和组织中表达量较高[19]。本研究发现,FKBP5基因和蛋白在阿勒泰羊心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、子宫、卵巢、输卵管、睾丸中均有表达,但在肝脏、子宫、卵巢、输卵管、睾丸表达量较高,这与在前人的相关研究结果一致[20],说明FKBP5基因在阿勒泰羊中也是广泛表达的,且在卵巢、输卵管和睾丸等生殖器官中表达量较高。定量和免疫组化结果也说明,FKBP5蛋白在卵巢的不同时期卵泡及不同类型细胞中也均有表达。

在松鼠猴的研究中发现,黄体酮能直接调控FKBP5基因的转录,并且FKBP5基因表达量的增加导致其对黄体酮的反应减弱[21]。在牛颗粒细胞中也发现,FKBP5基因的表达量在hCG诱导后的排卵前卵泡中显著升高,而在黄体中显著降低[13]。本研究发现,FKBP5基因的表达量随着卵泡发育不断升高,到黄体期又显著下降,大卵泡中FKBP5基因的表达量极显著高于小卵泡和黄体(P<0.01);并且在不同大小卵泡颗粒细胞中的表达也存在差异,大卵泡颗粒细胞的表达量显著高于小卵泡颗粒细胞中的表达量(P<0.05)。阿勒泰羊卵巢卵泡的直径直接反应其发育阶段,一般认为卵泡小于3 mm处于卵泡募集期,3～5 mm处于卵泡选择期,大于5 mm的卵泡就是优势卵泡或排卵前卵泡[22]。本研究结果与对牛的研究结果[13]类似,表明阿勒泰羊卵巢从募集期的小卵泡发育到排卵前的大卵泡,LH浓度不断升高的同时,黄体酮浓度也随之增加,从而在大卵泡时刺激FKBP5基因的转录,可能导致FKBP5基因在颗粒细胞中的表达增加而形成一个较短的负反馈循环,来参与减弱颗粒细胞分泌孕酮的反应,在黄体期又迅速下降。这将为深入研究FKBP5基因在阿勒泰羊卵巢中的调控及功能提供新的试验依据。

FKBP5蛋白作为一种支架蛋白,可以招募磷酸酶PHLPP来促进AKT及其下游靶点p38MAPKα(也被称为MAPK14)的去磷酸化,从而降低糖皮质激素受体的活化[23-24]。类似的机制可能与形成LH峰后的孕酮受体有关。在牛的研究中发现,颗粒细胞中AKT/p38MAPKα的磷酸化是通过对EGFR的激活而增加的,EGF样蛋白、表皮调节蛋白(EREG)和双调节蛋白(AREG)结合后,LH/hCG浓度的激增诱导了牛颗粒细胞中的EREG和AREG[25-26]。这种依赖于EGFR的AKT/p38MAPKα 通路的激活可能有助于孕激素受体的磷酸化和激活[27-28]。基于此推测,随着阿勒泰羊排卵前LH浓度升高,颗粒细胞中FKBP5蛋白的高表达可能会限制EGFR依赖的AKT/p38MAPKα 发生磷酸化,降低孕酮受体的磷酸化和活化,从而减弱排卵和初始黄体形成期间颗粒细胞分泌孕酮的反应性。为了验证这种推测还需在阿勒泰羊颗粒细胞上进一步研究。

4 结 论

本研究克隆得到阿勒泰羊FKBP5基因CDS区序列1390 bp,编码个462氨基酸;绵羊FKBP5基因与山羊和牛关系较近,与鸡(禽类)亲缘关系较远;阿勒泰羊FKBP5基因和蛋白在心、肝脏、脾、肺、肾、子宫、输卵管、卵巢和睾丸的表达存在差异,在输卵管中表达较高;在大、小卵泡及其不同细胞和黄体中的表达也存在一定差异,在大卵泡及其颗粒细胞中表达量较高;阿勒泰羊FKBP5蛋白在卵泡中各类细胞中均有表达。本研究初步探讨了FKBP5基因在阿勒泰羊卵巢中的表达和定位,但其在阿勒泰羊卵泡发育过程中的作用还需进一步研究。