黄萎病枯斑型与黄化型病症棉花叶片的植物挥发物对比

阳 妮,玛依拉·玉素音,杨延龙,李春平,张大伟,徐海江,赖成霞

(新疆农业科学院经济作物研究所,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】棉花在种植过程中易遭受黄萎病的侵害,随着大面积种植、连作年限的延长等原因,导致棉花黄萎病病害愈加严重,给棉花生产造成损失[1]。棉花黄萎病(CottonVerticilliumWilt,CVW)主要是由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的1种严重的土传真菌病害,侵染棉花主要表现为黄化状和枯斑状[2]。该病原菌的遗传稳定,潜伏期长,普通化学防治很难根除,在加上其具有丰富的变异性,同一病菌可能造成植株呈现相同、相似、或不同的表征,给黄萎病诊断和防治带来难度[3]。植物在面对病原菌侵染时,会产生某些与防御相关的代谢物质来抵御病原菌侵入,植物病症的形成与植物体内代谢物的变化有关,这些代谢物质不仅是植物基因复制、转录以及蛋白质表达的最终的产物,也是植物病症形成的物质基础[4-5]。因此,研究棉花黄萎病病症中的相关代谢物质变化,对于防治棉花黄萎病具有重要意义。【前人研究进展】植物挥发物物质(volatile organic compounds,VOCs)是植物与病原菌互作过程中的重要代谢物,大致分为脂肪酸衍生物、芳香族化合物、单萜和倍半萜类物质[6]。当植物受到病原菌侵害时,植物能通过改变挥发物的种类和数量上来抵御病原菌入侵,如油菜挥发物中的二甲基二硫醚(DMDS)、二甲基三硫醚(DMTS)和异硫氰酸烯丙酯(AITC)对三七根腐病菌均有抑菌活性,且浓度不同抑菌率也不同[7];在柑橘中挥发性的柠檬烯能抵御指状青霉菌、单胞杆菌等病原菌的入侵[8];绿叶挥发物中的(E)-2-己烯醛、(Z)-3-己烯醛等物质能诱导植物产生抗真菌蛋白、植物抗毒素来抵御病原菌的侵染[9]。气相色谱与质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)技术因具有较高的分辨率和较高的灵敏度,已成为研究挥发性代谢物的主要技术[10]。例如Batovska等[11]采用GC-MS技术比较了不同抗性葡萄叶片的代谢组分差异,获得了抑制白粉病菌、霜霉病菌及灰霉病菌的16种抗性代谢物。McCartney等[12]利用GC-MS技术对杜鹃花与雷公藤疫霉(Phytophthoraramorum)病原菌互作进行研究,检测出78种挥发性化合物。【本研究切入点】在棉花与黄萎病互作的研究中,仅有李社增等[13]通过液相色谱与质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)技术获得了一些与棉花黄萎病病程相关的代谢产物,如咖啡酸、紫云英苷、异紫云英苷、五桠果素等,而目前基于GC-MS技术上研究棉花中黄萎病不同病症的挥发性成分差异还未见报道。棉花在抵御病原菌入侵过程中,会发生大幅度的生理生化代谢及表型变化,而目前棉花对黄萎病的防御相关物质研究成果仍然不足以解析病症变化的机制。需研究黄萎病病原菌与棉花互作过程中的挥发性物质的变化。【拟解决的关键问题】采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME),结合GC-MS技术,检测分析棉花植株健康叶片、黄化状和枯斑状病叶中的挥发性物质变化,研究与病症差异相关的主要挥发性物质,为棉花抗黄萎病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花品种

供试棉花品种新陆早75号,健康叶片、枯斑状病片和黄化状病叶采自新疆沙湾市不同试验棉田的不同棉花植株,每个样本采集3个生物学重复用于代谢组学分析。取样后叶片样品用含水脱脂棉包裹叶柄并放入10℃的保鲜盒内,迅速带回实验室。

1.1.2 仪器与设备

SPME支架和65 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷纤维(DVB/CAR/PDMS)萃取头购自Supelco(美国Supelco公司); GC/MS-2020NX气质联用仪(日本岛津公司)。

1.2 方 法

1.2.1 样品制备

准确称取0.4 g棉花叶片,并分割成0.5 cm的小块状迅速放入 30 mL萃取瓶中,瓶盖用铝盖和封口膜进行密封。萃取头250℃老化30 min后,将萃取头插入萃取瓶的2/3处,31℃条件下萃取30 min,之后将萃取头插入GC-MS进样口内,进行GC-MS分析,每份样品重复3次。

1.2.2 挥发性成分

参照Qiu等[14]的方法进行挥发性成分的提取和分析,并做适当改动。具体条件如下,色谱柱:SH-Rtx-Wax(30 m×0.25 mm,0.25 μm)石英毛细管色谱柱;色谱柱初始温度35℃,保留5 min,按照4℃/min升温至60℃,再以3℃/min升温至180℃,然后以4℃/min升温至240℃,保留5 min;载气:高纯氦气;色谱柱流量:1 mL/min;分流,分流比6∶1,溶剂延迟0.5 min;接口温度:240℃。质谱条件:离子源为EI源,温度200℃,电子能量70 eV,采集方式为scan,质谱扫描范围:35～350 m/z。

1.3 数据处理

将样品总离子流色谱图中色谱峰的质谱图逐一与NIST 17谱库进行检索匹配,并对代谢物进行定性分析。采用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)对数据进行归一化处理,主成分分析(principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法判别(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA);通过SPSS 22进行t检验(Student’st-test);根据PLS-DA模型获得的变量重要性投影(variable importance in project,VIP)值(阙值﹥1)和t检验的P值(阙值﹤0.05)来筛选差异化合物,并采用Excel 2010和GraphPad Prism 9制作差异化合物的柱状图;韦恩图和条形图通过在线数据分析https://www.omicshare.com完成。

2 结果与分析

2.1 不同病症叶片的挥发性成分及含量变化

研究表明,与健康叶片相比,黄化状病叶叶色失绿变浅呈黄色,病叶边缘和主脉间出现黄色斑块,枯斑状病叶病斑色泽加深,变黄褐色,病叶边缘上卷,但主脉及其附近的叶肉仍保持绿色。各类叶片的质谱谱图,与NIST17质谱库检索,结合相关文献搜索查询,共鉴定出158种挥发性化合物,其中醇21种、绿叶挥发物9种、萜烯类49种、烷烃类16种、酯类38种、芳香烃类5种、醛类13种、其他类8种。不同病症叶片中的化合物数量差异较大,其中健康叶片检测到的化合物总数为104种、枯斑状病叶为112种、黄化状病叶为54种,且黄化状病叶中未检测到芳香烃类物质。枯斑状病叶中的醇类、绿叶挥发物、酯类、烷烃类、芳香烃类、醛类和其他类的相对含量均大于黄化状病叶、萜烯类小于黄化状病叶。在所有化合物类别中,萜烯类和绿叶挥发物的比例最大,健康叶片、黄化状病叶和枯斑状病叶的萜烯类物质占比分别为35.04%,62.61%和42.31%,其中香柑油烯、(E)-β-金合欢烯、(+)-苜蓿烯、别香橙烯、榄香烯、萜品油烯、E-11,13-十四二烯和长叶烯-(V4)只存在于枯斑病叶中;绿叶挥发物在健康叶片、黄化状病叶和枯斑状病叶中的占比为54.58%、29.73%和46.78%,其中3-己烯醛是枯斑病叶中的特有成分;醇类化合物在健康叶片、黄化状和枯斑状病叶占比分别为5.27%、3.64%、4.40%,十氢化萘-2-醇只存在于黄化状病叶中,枯斑病叶中包含了5种特有成分,以松香芹醇含量最高;而烷烃类、醛类、酯类、芳香烃类、其他类的含量较低,均在4%以下,健康叶片含量最高的化合物是水杨酸甲酯,且此物质未在病叶中未检出,黄化状病叶和枯斑病叶含量较高的是β-苯丙氨酸。图1,表1

表1 不同病症叶片的挥发性成分及含量变化

注:CK:健康叶片,Y:黄化状病叶,K:枯斑状病叶。下同

2.2 主成分分析与偏最小二乘法判别

研究表明,3组样本中PC1和PC2的贡献率分别为50.3%、24.9%,其中CK组、K组、Y组分别位于第一、二、四象限上,组间化合物分离趋势明显且组内生物重复性好,3组间化合物有较大差异。使用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)表明,组内数据重复性好,3组样品的区分效果非常明显,具有明显不同的代谢特征。图2

注:A:PCA分析图;B:PLS-DA分析图。

2.3 差异化合物筛选

研究表明,设定条件为VIP >1.0,且P<0.05。K和CK间存在61种差异化合物(23种上调/39种下调),主要包括12种醇类、20种萜烯类、13种酯类、6种烷烃类、3种醛类、1种绿叶挥发物,2种芳香烃类和4种其他类物质。Y和CK间存在24种差异化合物(14种上调/10种下调),包含醇类2种、萜烯类14种、酯类5种和烷烃类3种;K和Y共有差异化合物26种(19种上调/7种下调),包含3种醇类、10种萜烯类、6种酯类、3种烷烃类、2种醛类、1种绿叶挥发物和1种其他类物质。图3

图3 不同病症叶片的差异化合物筛选

2.4 不同病症叶片的差异化合物变化

研究表明,化合物β-蒎烯在3个比较组间均发生了差异变化,其中K组、Y组与CK组相比分别上调了2.33、3.97,而K组与Y组相比下调了1.65。与CK相比,K组和Y组中有5个共有化合物发生差异变化,其中角鲨烯、坎烯、(E)-2-丁酸己烯酯在病症叶片中显著下调,香橙烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇显著上调,且这些化合物在Y组中的变化更大。K组与Y组的相比,有13个差异化合物与K组相连,其中以(Z)-2-丁酸己烯酯倍数变化最大,上调3.76,5个差异化合物与Y组相连,倍数变化最大化合物是(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,下调3.03,7个化合物发生特有表达,其中(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依兰油烯和正十六烷均显著上调,且变化倍数均大于2。图4

注:A: 差异化合物韦恩图;B-D: 差异化合物条形图,红色代表上调,蓝色代表下调

3 讨 论

SPME是一种集萃取、浓缩、进样等功能为一体的检测方法,灵敏性高且操作简单,被应用于提取各类样品,如甘薯[15]、西洋参[16],同样也被用于植物-病原菌互作中挥发性物质的提取,如Chen等[17]采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用法,从豆根内生真菌ETR-B22中共鉴定出了32种挥发性有机化合物,其中邻氨基甲酸甲酯、水杨酸甲酯、苯甲酸甲酯等表现出广谱抗真菌活性。研究利用SPME-GC-MS技术,从3组样品中获得了包括醇类,绿叶挥发物、萜烯类、烷烃类、酯类,芳香烃类和醛类在内的158种挥发性化合物,SPME应用于挥发性物质提取是可行的。郑雪芳等[18]采用GC-MS法对青枯菌菌株侵染后的番茄进行了化合物分析,检测到的化合物种类主要有萜烯类、醇类、酯类和烷烃类,且致病性不同的菌株化合物数量也不同。研究在不同病症叶片中也检测出不同数量的化合物,其中健康叶片的化合物总数为104种、枯斑状病叶为112种、黄化状病叶为54种,病症叶片中的化合物数量差异较大,其差异主要集中于萜烯类、酯类化合物上。各类别物质的相对含量变化反映了寄主植物对病原菌的响应,ROBISON等[19]利用UPLC-MS和GC-MS研究发现感染核盘菌后,抗性大豆品种中的萜烯类含量增加,而酯类、氨基酸及糖类减少。在研究中,健康叶片和病症叶片中各类别物质含量差别明显,可能是导致了病叶呈枯斑和黄化状的重要原因。其中枯斑状病叶中的醇类、绿叶挥发物、酯类、烷烃类、芳香烃类、醛类和其他类的相对含量均大于黄化状病叶、萜烯类小于黄化状病叶。

在大丽轮枝菌与棉花互作中,包括半棉酚、棉酚、半棉酚酮在内的萜类物质和酚类物质是棉花抗病工作过程中的重点之[20]。研究从枯斑状病叶、黄斑状病叶分别筛选到了61、24个差异化合物,通过对比比较,从两个病症叶片中筛选到了6种共有差异化合物,主要为萜烯类、酯类等物质,这些类别物质可能是棉花抗黄萎病过程中的重要代谢组分。其中β-蒎烯更是在病症叶片中显著上调,且在黄化状病叶中的表达倍数大于枯癍病叶,其作为萜烯类中的重要物质,在植物抗逆过程中起重要作用[21]。高全等[22]研究显示草果挥发油中发挥抑菌作用的主要活性成分为β-蒎烯;张美红等[23]在研究叶同样证实了β-蒎烯可显著抑制柑橘青霉菌生长繁殖,抑菌作用的大小与其浓度正相关。在枯斑状病叶与黄化状病片比较中发现了(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依兰油烯和十六烷等差异化合物均发生显著的倍数变化。(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯已被证实是棉花抗逆过程中具有挥发性质的间接防御物质[24]。智亚楠等[25]曾在研究中证实了(Z)-3-己酸己烯酯对茶树轮斑病菌具有抑制能力,其熏蒸抑制率可达到27%。(Z)-3-己烯基乙酸酯是绿叶挥发物重要成分,在增强小麦对禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)的防御能力、提高马铃薯对晚疫病的抗病能力等生物胁迫方面发挥作用[26-27]。γ-依兰油烯已被鉴定是果实精油中的主要成分,具有良好的抗生物膜活性和抑制病原菌粘附的性质[28]。以上鉴定出的挥发性化合物在大丽轮枝菌与棉花互作相关文献中未见报道,可能为新发现的棉花与病原菌互作过程中相关化合物,这些化合物的含量差异是病症叶片呈现不同表型的关键。

4 结 论

4.1枯斑型叶片与黄化型叶片中的化合物数量差异较大,其差异主要集中于萜烯类、酯类化合物上,其中枯斑病叶的萜烯类、酯类化合物分别有37种、26种,而黄化状病叶为24种、8种。枯斑状病叶中的醇类、绿叶挥发物、酯类、烷烃类、芳香烃类、醛类和其他类的相对含量均大于黄化状病叶、萜烯类小于黄化状病叶。枯斑病叶以绿叶挥发物(46.78%)的相对含量最高,黄化状病叶以萜烯类(62.61%)最高,且黄化状病叶无芳香烃类物质。

4.2与健康叶片相比,β-蒎烯、(E)-2-丁酸己烯酯、坎烯、角鲨烯、香橙烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇均在病症叶片显著富集,且在黄化状病叶的变化倍数大于枯斑病叶。枯斑病叶与黄化状病叶相比,(Z)-2-丁酸己烯酯,(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依兰油烯和正十六烷均发生了显著性倍数变化,差异化合物是黄萎病菌与棉花互作的结果,是病症叶片呈现不同表型的关键。