预熟制处理对三疣梭子蟹冻藏品质的影响

孙仲麒，苏兰香，黄 涛，贾 茹，魏华茂*，杨文鸽*

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国重要的经济蟹类之一，其肉质鲜嫩、蛋白含量高、必需氨基酸齐全且风味独特，深受广大消费者喜爱[1]。据统计，2021年我国海捕蟹总产量为64.71万 t，其中三疣梭子蟹45.45万 t，占海捕蟹的70.24%[2]。然而，梭子蟹销售受季节影响严重，供需不稳定，价格波动显著。因此，梭子蟹除了以鲜活方式销售外，常被冻藏保存，以解决禁渔期梭子蟹短缺的问题。冻藏可显著延长梭子蟹的货架期，但蟹肉的含水量高、纤维组织柔嫩且内源酶活性强，直接冻藏易导致肌肉蛋白变性、肌纤维糜化、肌肉品质劣化，进而严重影响其食用品质和经济效益[3]。杨志坚[4]指出，蟹肉中冰晶随冻藏时间的延长而逐渐增大，引起肌肉蛋白脱水变性，蛋白质溶解性降低、疏水性增加，导致解冻后再加热熟制的蟹肉汁液流失严重、肉质口感下降。因此，开发梭子蟹预处理方式以减缓其贮藏过程中品质劣化速率至关重要。

近年来，随着我国预制菜产业及水产品对外贸易的发展，预熟制水产品越来越受到消费者的青睐，其出口量也不断上升，而预熟制蟹类产品在生产、加工以及贮藏过程中的品质是决定其经济价值的主要因素[5]。研究表明，预熟制处理不仅可以减菌、降低酶活性、改善肌肉品质、赋予产品特殊的风味色泽、延长货架期，还可以有效减少冻藏过程中蟹脚脱落，大幅提高产品的稳定性和安全性[6]。陈德慰[7]指出，熟制大闸蟹经柠檬酸处理后总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量降低，货架期显著延长，而使用三聚磷酸钠处理则会促进TVB-N生成，使其货架期缩短。施祁燕等[8]将熟制的中华绒螯蟹剥壳后按照不同部位进行冻藏，发现蟹肉在240 d后仍可食用，而蟹膏、蟹黄的货架期只有180 d。目前，预熟制技术的应用主要集中在河蟹的加工中，对三疣梭子蟹在冻藏过程中品质变化的研究鲜有报道。

鉴于此，本实验以三疣梭子蟹为研究对象，比较新鲜与预熟制处理三疣梭子蟹在冻藏过程中pH值、TVB-N含量、菌落总数（total viable count，TVC）、持水性（water holding capacity，WHC）和色泽的变化，结合肌肉蛋白组成以及微观结构，探究预熟制梭子蟹在冻藏过程中的品质变化规律，旨在为预熟制三疣梭子蟹的贮藏品质及其货架期预测提供参考，以确保水产品的食用品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活三疣梭子蟹（P.trituberculatus），质量为（173.8±25.3）g，2021年12月捕捞于浙江舟山海域，2 d内在海水中暂养并运至宁波路林水产批发市场，随后冰藏于泡沫箱中，1.5 h内运至实验室，冰包埋致死以便后续实验。

氢氧化钠、氯化钠、盐酸、硼酸、氧化镁、乙醇、甲基红、溴甲酚绿（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸（分析纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三(羟甲基)氨基甲烷、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索莱宝科技有限公司；琼脂培养基 杭州微生物试剂有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 福斯分析仪器（苏州）有限公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；ML104/02型电子天平 梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；S-3400N型扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

三疣梭子蟹随机分为3 组：1）对照组（control，C组）：梭子蟹冻藏后，冰水浴解冻2 h后取肉样检测；2）熟制后冻藏组（heating followed by frozen storage，H-F组）：梭子蟹置于蒸锅中，待水沸腾后蒸12 min至完全熟透，冰上冷却至室温后冻藏，冰水浴解冻2 h后取肉样检测；3）冻藏后熟制组（frozen storage followed by heating，F-H组）：梭子蟹冻藏后，冰水浴解冻2 h后置于蒸锅内，待水沸腾后蒸12 min至完全熟透，冰上冷却至室温后取肉样检测。取肉部位均为梭子蟹的螯足及附近肌肉。

所有梭子蟹冻结前均采用无菌塑封袋单独封口包装，先于−40 ℃冷冻2 h，后转移至−20 ℃冰箱冻藏，180 d内定期对各指标进行测定。

1.3.2 色泽的测定

使用标准白板校正色差仪，再测定蟹肉色泽。白度（W）为L*（明亮度）、a*（红绿度）和b*（黄蓝度）值的综合指标，按照公式（1）计算[9]。

1.3.3 pH值的测定

参考Fan Wenjiao等[10]方法，准确称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入9 倍体积超纯水后均质，静置30 min后取其上清液，用pH计进行测定。

1.3.4 TVB-N含量的测定

参照GB 5009.228－2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[11]的方法，准确称取2.0 g样品，采用自动凯氏定氮仪测定，结果以mg/100 g表示。

1.3.5 TVC的测定

参照GB 4789.2－2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[12]的方法，结果以lg（CFU/g）表示。

1.3.6 扫描电子显微镜观察

按L i a n g F e n g 等[13]方法稍加修改。将蟹肉平行于肌原纤维伸展方向进行横切，取样尺寸为3 mm×3 mm×1 mm，浸没于2.5%（体积分数，下同）戊二醛中，于4 ℃冰箱内固定24 h；用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；依次用不同体积分数乙醇（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）洗脱，再用无水乙醇和叔丁醇以体积比3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的混合液依次洗脱，每次10 min；最后用少量叔丁醇覆盖样品，冷冻干燥。将冷冻干燥样品贴于铜质样品台上方，喷金后用于扫描电子显微镜观察，加速电压为10 kV。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

参考Jia Ru等[14]的方法并略作修改。取0.5 g蟹肉，加入20 mL缓冲液（8 mol/L尿素-2% SDS-20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8），用磁力搅拌器搅拌过夜，4 ℃冷冻离心（10 000 r/min、10 min），取上清液待测。用BCA蛋白浓度试剂盒测定上清液蛋白质量浓度，并将其稀释至2 mg/mL，加5%β-巯基乙醇（与稀释过的蛋白溶液体积比为1∶4），随后在沸水浴中加热10 min，冷却备用。

采用5%浓缩胶和12%分离胶，每孔样品上样量为10 μL。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）起始电压为80 V，样品进入分离胶后将电压调为100 V。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色，纯水煮沸脱色，最后用凝胶成像仪拍照分析。

1.3.8 WHC的测定

参考Tabilo-Munizaga等[15]的方法测定WHC。准确称取2.0 g样品，将其用滤纸包裹置于50 mL离心管中，4 ℃离心10 min，转速为3 000 r/min。记录离心前的样品质量（m1/g）和离心后的样品质量（m2/g），WHC按照公式（2）计算。

1.4 数据统计与分析

每项实验重复3～5 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 28.0软件中ANOVA对实验数据进行Duncan方差分析，以P＜0.05表示差异显著；用GraphPad Prism 8.0.1软件绘图，并用Origin 9.2软件作相关性分析。

2 结果与分析

2.1 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间pH值变化的影响

pH值是水产品品质中比较简单易测的指标之一，能反映动物死后糖原转化为有机酸以及肌肉组分（如蛋白质和核酸）的降解情况[16]。

由图1可以看出，冻藏期间对照组（C组）pH值呈现先下降后上升的“V”型趋势，0 d时蟹肉pH值为6.85±0.05，与金超等[17]的结果一致，表明样品呈现高鲜度。随着冻藏时间的延长，梭子蟹体内糖原分解产生乳酸等有机酸，导致pH值逐渐降低，C组前30 d pH值显著下降（P＜0.05），并达到最低值6.30±0.04，之后在微生物及内源酶的共同作用下生成碱性含氮物，导致pH值升高。对于H-F组和F-H组而言，蟹肉pH值均高于C组，主要原因是蟹壳中含有较多的碱性物质，在高温熟制过程中逐渐渗透到肌肉中，同时加热还会引起肌肉蛋白产生一些小分子含氮物，引起pH值的升高[18]。冻藏期间，H-F组和F-H组蟹肉的pH值均呈现出先上升后下降直至平稳的趋势，并均在冻藏30 d时达到最高值。

图1 冻藏期间三疣梭子蟹蟹肉pH值的变化Fig.1 Changes in pH of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.2 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间TVB-N含量变化的影响

TVB-N含量可以反映肉制品在微生物和内源酶作用下，蛋白质及非蛋白含氮物降解为氨、生物胺等碱性物质的情况，是评判肉品新鲜度的一个重要指标[19]。GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》规定海蟹的TVB-N限值为25 mg/100 g[20]。

由图2可知，3 组样品的TVB-N含量随冻藏时间的延长均呈现上升趋势，其中C组TVB-N含量在各时间均存在显著性差异（P＜0.05）。0 d时C组蟹肉的TVB-N含量为（5.02±0.23）mg/100 g，低于加热组（H-F组和F-H组）（（8.05±0.35）mg/100 g），主要是因为加热可引起部分蛋白质降解，引起挥发性含氮物质含量的增加，从而导致TVB-N含量增加。冻藏期间，C组蟹肉TVB-N含量稳定增加，在冻藏30、120 d和180 d时分别为（10.97±0.20）、（18.78±0.58）、（23.45±0.35）mg/100 g，均低于GB 2733—2015限值，表明梭子蟹在贮藏180 d后仍可食用。H-F组的TVB-N含量在前10 d无显著性变化（P＞0.05），到第30天时，H-F组TVB-N含量为（10.27±0.23）mg/100 g，F-H组为（10.87±0.37）mg/100 g。冻藏时间超过30 d后，由于蛋白质降解以及微生物滋生等因素，TVB-N含量增长速率加快。冻藏180 d时，H-F组的TVB-N含量为（21.12±0.58）mg/100 g，低于C组和F-H组。可见，预熟制可有效抑制梭子蟹在冻藏期间蛋白质的腐败变质，延缓TVB-N含量的增加，从而达到延长货架期的效果。

图2 冻藏期间三疣梭子蟹蟹肉TVB-N含量的变化Fig.2 Changes in TVB-N content of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.3 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间TVC变化的影响

TVC是评价食品被细菌污染程度的一个常见指标[21]，根据国际食品微生物委员会（International Commission on Microbiological Specifications for Food，ICMSF）[22]和GB 10136－2015《食品安全国家标准 动物性水产制品》[23]规定，即食生制动物性水产制品TVC不得高于5.0（lg（CFU/g））。

F-H 组在指标测定前有加热处理，故仅测定C组和H-F组的TVC变化。由图3可以看出，与第0天相比，C 组和H-F 组其他时期的T V C 均显著升高（P＜0.05），并且H-F组增加速率始终小于C组。冻藏初期（第0 天）C 组和H-F 组的T V C 分别为（1.77±0.07）、（1.57±0.23）（lg（CFU/g）），主要是因为熟制处理具有杀菌作用，可有效降低内源酶活性，C组冻藏120 d后的TVC为（3.87±0.07）（lg（CFU/g）），约为新鲜蟹肉的100 倍，而H-F组的TVC则在150 d时达到熟制新鲜蟹肉的100 倍；冻藏180 d后，H-F组TVC为（4.03±0.17）（lg（CFU/g）），低于C组（（4.60±0.10）（lg（CFU/g））），且两组均低于标准限值，说明在冻藏过程中仍有微生物滋生，但熟制后冻藏有助于降低蟹肉的TVC。Lorentzen等[24]指出，熟制后的雪蟹不论是－20 ℃冻藏还是先－40 ℃处理再－20 ℃冻藏，前4 d TVC均低于1.70（lg（CFU/g）），且在冻藏第9天，96 ℃熟制148 s组雪蟹的TVC显著低于87 ℃熟制430 s组；Sarnoski等[25]研究表明，生雪蟹初始的TVC为1.65（lg（CFU/g））。综上所述，熟制预处理可显著减缓梭子蟹在冻藏期间微生物的增长速率，延长货架期，这与TVB-N含量的测定结果一致。

图3 冻藏期间三疣梭子蟹蟹肉TVC的变化Fig.3 Changes in TVC of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.4 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间WHC变化的影响

WHC是反映在外力作用下，食品组织牢固束缚住自身和外加水的能力。研究表明，蟹肉的嫩度、口感、柔软性与WHC有很大关系，新鲜状态下蟹肉WHC良好[26]。

由图4 可知，C 组第0 天的W H C 为（78.13±0.97）%，高于加热组（H-F组和F-H组，（75.71±0.46）%），这是因为经过加热处理后蛋白质变性，肌纤维和肌肉结缔组织被破坏，疏水基团暴露，最终引起WHC下降[27]。3 组蟹肉的WHC均在前10 d显著降低（P＜0.05），C组在第60天下降至（69.51±0.82）%，之后下降趋势减缓。H-F组蟹肉的WHC始终高于F-H组，180 d时为（64.57±0.89）%，而F-H组则降为（62.50±0.60）%，这是因为冻结过程中，水分会在相变过程中转化为冰晶，冰晶的膨胀压力会导致肌肉组织细胞形态改变、机械损伤等，从而导致WHC下降[28]；同时，因为预熟制会使蛋白质变性聚集并形成凝胶，使得更多的水分子结合在凝胶基质中，从而提高了其WHC。Wang Wenting等[29]研究发现，热诱导肌浆蛋白可以促使其聚集并形成凝胶，对提高肉品WHC有重要意义；Powell等[30]报道温度升高到90 ℃以上时，肌外膜、肌束膜和肌内膜中的胶原蛋白会克服分子间力的束缚，逐渐溶解，进而凝胶化形成明胶，对肉中水分起到一定程度的保留作用。

图4 冻藏期间三疣梭子蟹蟹肉WHC的变化Fig.4 Changes in WHC of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.5 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间肌肉蛋白组成的影响

如图5所示，肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）（200 kDa）和肌动蛋白（Actin）（42 kDa）为主要蛋白。随冻藏时间延长，C组蟹肉小分子蛋白条带逐渐增多，这与冻藏期间大分子蛋白降解有关，可能是由于冻藏期间冰晶的生成引起肌肉蛋白空间结构改变[31]以及内源性蛋白酶和微生物滋生所产生的蛋白酶引起，相似的结论也在中华绒螯蟹中被报道[32]。经熟制处理后，蟹肉的MHC条带变浅，而其他条带的出现表明熟制处理可引起蟹肉蛋白结构的破坏。戴妍[33]也报道经欧姆加热的猪肉，其MHC会轻微降解，主要是在某一温度下内源酶的高活性引起的。此外，对于F-H组而言，一方面和C组样品一样，随着冻藏时间的延长其肌肉蛋白逐渐被降解；另一方面，解冻后的梭子蟹在熟制的过程中，部分肌肉蛋白也会因某一温度下蛋白酶的高活性作用而被降解，因此相对于C组和H-F组，180 d时F-H组MHC的降解更为明显。

图5 冻藏期间三疣梭子蟹肌肉蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.5 SDS-PAGE profiles of P.trituberculatus meat proteins during frozen storage

2.6 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间肌肉微观结构的影响

如图6所示，0 d时C组蟹肌肉排列清晰、致密整齐，肌纤维明显且粗壮，表明新鲜梭子蟹肌肉品质良好；冻藏30 d后肌纤维仍明显粗壮、致密，肌肉结构变化不大；继续冻藏后肌纤维结构逐渐变细小且无序，180 d后肌肉结构杂乱且模糊，此时蟹肉呈糜状，食用品质下降。秦辉[34]报道中华绒螯蟹在－24 ℃下冻藏6 个月后，由于自身酶系的作用，肌肉纤维由清晰壮实变为模糊细短，且蛋白质网状结构基本消失，本研究结果与之类似。本研究中可以明显观察到加热组（H-F组、F-H组）肌纤维结构的变化，原因在于加热促进了肌肉蛋白的交联和聚集，相比H-F组，F-H组蟹肉肌纤维排列无序化程度及肌纤维孔隙较大，180 d时肌肉呈现连续的断裂现象，说明肌节变短、蟹肉呈糜状。由此可以说明，预熟制处理后冻藏对蟹肉的肌纤维结构有一定的保护作用，这与蟹肉WHC和肌肉蛋白组成的测定结果相印证。

图6 冻藏期间三疣梭子蟹肌肉微观结构的变化（×3 000）Fig.6 Changes in microstructure of P.trituberculatus meat during frozen storage (× 3 000)

2.7 预熟制处理对梭子蟹在冻藏期间肌肉色泽的影响

良好的色泽呈现有助于提高消费者对于产品的接受度，W值是衡量蟹肉品质的一个重要指标，与WHC及蛋白质的变性程度呈一定程度的正相关[35]。由表1可知，与第0天相比，加热组（H-F组、F-H组）W值均呈下降趋势，尤其是冻藏后期显著降低（P＜0.05）；W值越低表明蟹肉颜色越暗，其品质越差，可能是冻藏期间水分的散失及肌肉蛋白或脂质发生氧化造成了蟹肉色泽变暗[36]。冻藏初期，C组的b*值减小，说明由肌肉颜色由黄变蓝，可能是由于冻藏过程中蟹体的血蓝蛋白发生氧化变成蓝色，导致b*值减小[37]。与C组相比，加热组（H-F和F-H组）经过熟制，W值都有不同程度的增加，且H-F组的W值略高于F-H组，可能是熟制时的高温使肌红蛋白和血蓝蛋白变性，以及在冻藏过程中冰晶的形成，共同导致了肌肉结构蛋白肌纤维直径减小、肌节收缩，进而影响了光在肌肉中的散射，最终导致了W值的下降[27]。李双琦等[38]在研究中指出，低温真空烹饪的鲈鱼肉L*值及a*值均高于传统沸煮的鲈鱼肉；王丹青[39]则指出经低盐度海水暂养后，中华绒螯蟹蟹壳、蟹黄a*值均提高，蟹膏L*值增加。

表1 冻藏期间三疣梭子蟹蟹肉色泽的变化Table 1 Changes in color parameters of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.8 蟹肉品质指标的相关性分析

如图7所示，TVB-N含量和TVC存在极显著正相关，说明梭子蟹品质的下降伴随着氨和胺类等碱性含氮物质的生成，以及细菌的滋生。TVB-N含量与WHC、W值分别呈显著和极显著负相关，主要是因为冻藏期间冰晶的生成会使蛋白质发生变性与聚集，引起蛋白质空间结构的改变，导致肌肉失水、颜色变暗，最终促使蟹肉品质劣变。综上所述，蟹肉冻藏过程中品质变化可由TVB-N含量、TVC、WHC以及W值等指标评价。

图7 三疣梭子蟹蟹肉pH值、TVB-N含量、TVC、WHC、W值的相关性分析Fig.7 Correlation analysis among pH, TVB-N content, TVC, WHC and whiteness of P.trituberculatus meat

3 结 论

本研究探究预熟制处理对三疣梭子蟹在冻藏过程中肌肉生化特性的影响，结果表明，加热导致梭子蟹肌肉W值升高，而冻藏时间延长则使W值下降。经预熟制处理的梭子蟹在冻藏过程中pH值比较稳定，TVB-N含量和TVC增长较为缓慢，WHC保持较好，肌肉断裂程度较小。说明预熟制处理可有效减缓梭子蟹在冻藏期间的品质劣化，对延长货架期有着积极作用，本研究结果可为三疣梭子蟹预制菜的加工贮藏提供参考依据。