异硫氰酸酯类(ITCs)调味品中二氧化硫残留值超标原因的研究

李伟,王嘉豪,刘均,马永强

(1.哈尔滨商业大学 食品工程学院,哈尔滨 150028;2.东莞市永益食品有限公司,广东 东莞 523106)

二氧化硫是一种无色、有刺激性气味的气体,其存在形式或前体有单质硫、焦亚硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸等。二氧化硫类添加剂在食品和中草药中使用较广泛,限量内的二氧化硫具有防腐、抗氧化、漂白等功能[1-2],但添加过量将严重影响身体健康[3]。因此,建立准确的二氧化硫定量方法十分必要。我国现行国家标准GB 5009.34—2016采用滴定法,其原理是利用碘的标液氧化亚硫酸根。需要注意的是,定量的前提是定性,如果分析方法本身的选择性不强,比如化学滴定法,就会导致定量结果出现误差。

异硫氰酸酯(ITCs)是一类具有辛辣刺激性味道的风味物质,天然存在于十字花科植物中,如辣根、芥末、山葵等,主成分为异硫氰酸烯丙酯(AITC)[4-5]。以其为原料制成的青芥辣、芥末油、辣根粉等调味品常见于大众饮食中。质检部门在对含异硫氰酸酯类(ITCs)调味品的二氧化硫残留检测(GB 5009.34—2016)中经常发现超标现象,而事实上厂家并未使用二氧化硫类添加剂。针对此问题,我们对可能的影响因素进行了实验研究。

1 材料和方法

1.1 材料

青芥辣、辣根粉和芥末油:购于超市。

1.2 试剂

异硫氰酸烯丙酯(含量>99%):滕州瑞元香料有限公司;0.1 mol/L碘标准溶液(批号:20210927H):北京中科质检生物技术有限公司;1 000 mg/L硫酸根标准溶液(批号:210860):水利部水环境监测评价研究中心。

1.3 主要仪器与设备

SP756型紫外可见吸收光谱仪 上海光谱仪器有限公司;GC7890-MS5975气质联用仪 美国安捷伦科技有限公司;Metrohm 883离子色谱仪 瑞士万通中国有限公司;ZNCL智能数显磁力电热套 巩义市予华仪器有限责任公司;PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司。

1.4 方法

1.4.1 异硫氰酸酯类(ITCs)调味品中ITCs含量的测定[6]

以异硫氰酸烯丙酯(AITC)作为标准品,检测样品中异硫氰酸酯类(ITCs)的含量。

标液配制及标准曲线制作:母液配制:准确称取 0.050 0 g AITC溶于正己烷中,转移至50 mL容量瓶中定容,得到浓度为1.000 mg/mL的AITC溶液。依次移取母液20,40,60,80,100 μL于10 mL容量瓶中,用正己烷稀释定容,得到20,40,60,80,100 μg/mL的AITC标准溶液。紫外光谱扫描:确定最大吸收波长249 nm。采用光度扫描方式,按浓度由低到高测定标准溶液的吸光度值,平行测试2次,按吸光度-浓度关系制作AITC的标准曲线。

样品处理与测试:称取约0.20 g样品于烧杯中,加入3 mL蒸馏水后搅拌均匀,用5 mL正己烷萃取2次,合并后依次用蒸馏水、饱和氯化钠溶液洗涤,经无水硫酸钠干燥后,转移至25 mL容量瓶中定容,待测。

1.4.2 异硫氰酸酯类(ITCs)调味品中二氧化硫残留量的测定[7]

根据ITCs含量高、中、低选取3份青芥辣样品以及辣根粉和芥末油各1份。按照国标方法操作,首先,组装仪器,连接500 mL蒸馏瓶与蛇形冷凝管,其下端出口接上硅胶管,并插入锥形瓶内的醋酸铅溶液中,保证装置的气密性。然后称取样品约5.00 g,青芥辣样品用水少量多次溶解、搅拌分散后转入蒸馏瓶内,辣根粉称量后直接转入蒸馏瓶内,芥末油样品称量后,用水少量多次冲洗称量舟,蒸馏瓶内每份样品加入蒸馏水总计250 mL,安装蛇形冷凝管,为避免蒸馏瓶底部过热导致样品糊底,蒸馏过程中采用磁力搅拌,待样品搅拌2 min后迅速加入10 mL盐酸(6 mol/L),盖好瓶塞,开启加热功能。蒸馏时间约2 h,蒸馏液达到约200 mL后,放下锥形瓶,继续蒸馏1 min,用蒸馏水冲洗硅胶管插入溶液部分。最后进行滴定操作,迅速向锥形瓶内加入10 mL盐酸、1 mL淀粉溶液(1%),摇匀后立即用碘标准溶液滴定至蓝色,维持30 s不褪色即为终点,记录读数。每个实验平行2次。

二氧化硫含量按下式计算:

式中:X表示样品中二氧化硫含量,mg/kg;V表示滴定样品所用碘标准溶液体积,mL;V0表示空白实验所用碘标准溶液体积,mL;m表示称取样品质量,g;c表示碘标准溶液浓度,mol/L;0.032表示1 mL碘标准溶液[c(1/2 I2)=1.0 mol/L]相当于二氧化硫的质量,g。

1.4.3 异硫氰酸烯丙酯(AITC)在国标条件下的对照实验

以AITC标准品作为研究对象,分别称取两组30,50 μL的AITC标准品,按“2.2”中方法进行操作分析。

闻喜被称为“花馍之乡”，制作花馍历史悠久，作为一项与劳动人民生活中产生的艺术，已有1000多年的历史了，从先秦时期就有有关记载，最早是用来祭祀的，人们把它做成猪、牛、羊等动物的模样来祭祀祖先。因闻喜花馍技艺独特、历史悠久，在2006年与定襄面塑、焙面面塑、新绛面塑共同作为山西面塑艺术入选省级非物质文化遗产名录；2008年以其独有的食用、观赏、礼仪功能，作为传统美术—面花的成员被列为第二批国家级非物质文化遗产，这些都是对闻喜花馍的肯定和鼓励。

1.4.4 异硫氰酸烯丙酯(AITC)在酸性条件下水解产物的分析

取一支20 mL的顶空样品瓶,依次加入磁子、10 mL蒸馏水、50 μL AITC和2 mL盐酸,压好胶垫和盖子,磁力加热搅拌1 h。冷却至约50 ℃,维持温度恒定,插入活化好的固相微萃取针头,静态吸附10 min,然后用气质联用仪(GC-MS)进行分析。

仪器测试条件:气相色谱(GC):弹性石英毛细管柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),载气(He)流量1 mL/min,进样口温度250 ℃,分流比30∶1。程序升温:柱温60 ℃保持1 min,然后以10 ℃/min升至220 ℃,保持5 min。质谱(MS):EI离子源温度230 ℃,质量扫描范围28～550 u,四极杆温度150 ℃,电离电压70 eV。采用NIST 14标准质谱数据库匹配对照定性分析,面积归一化法计算各组分的相对百分含量。

1.4.5 离子色谱法检测二氧化硫残留量

操作步骤同上,称取样品约10 g,为避免亚硫酸根被氧化,冷凝管下端插入250 mL容量瓶内的吸收液中,瓶内盛有50 mL的3%双氧水、5%抗坏血酸溶液或者淋洗液作为吸收液。蒸馏时间约2 h后,取下容量瓶,冲洗硅胶管,用蒸馏水定容。取约5 mL蒸馏液经C18固相萃取小柱纯化后,再经0.45 μm微孔滤膜过滤,进行离子色谱仪的上样分析。

淋洗液配制:称取0.339 2 g Na2CO3和0.084 0 g NaHCO3溶解后转移至1 L容量瓶中,加入50 mL丙酮试剂,加入去离子水定容,得到3.2 mmol/L Na2CO3+1.0 mmol/L NaHCO3+5%丙酮的淋洗液。

标准曲线的制作:移取100 μg/mL的硫酸根标准溶液10,50,100,500,1 000 μL至10 mL容量瓶中,稀释定容后得到0.10,0.50,1.00,5.00,10.0 μg/mL的硫酸根标准溶液。

二氧化硫(SO2)含量按下式计算:

式中:X表示样品中二氧化硫含量,mg/kg;C表示样品馏出液中硫酸根(SO42-)浓度,μg/mL;V表示蒸馏定容体积,mL;m表示称取样品质量,g;0.667表示SO42-换算成SO2的系数。

2 结果与分析

2.1 异硫氰酸酯类(ITCs)调味品中ITCs含量的比较

图1 异硫氰酸烯丙酯(AITC)的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectrum of allyl isothiocyanate (AITC)

图2 异硫氰酸烯丙酯(AITC)的标准曲线Fig.2 Standard curve of allyl isothiocyanate (AITC)

对在售的10个品牌的青芥辣酱及2个品牌的辣根粉进行了异硫氰酸酯类化合物(ITCs)含量测定,结果见表1。

表1 不同品牌、类别调味品中异硫氰酸烯丙酯(ITCs)含量Table 1 Content of isothiocyanates (ITCs) in different brands and types of condiments

青芥辣的ITCs含量大约在1%,含量越高,其味道越浓烈,如1#和2#样品,而ITCs含量较低的3种青芥辣产品——3#、7#、10#,均为日本进口产品,其ITCs含量低于0.3%。相比之下,用于制作青芥辣的辣根粉原料——11#、12#,其ITCs含量低于国产青芥辣,而高于进口青芥辣,这一数据表明国产青芥辣产品中存在不同程度的人工合成异硫氰酸烯丙酯(AITC)的添加。

2.2 异硫氰酸酯类(ITCs)调味品中二氧化硫残留量的测定

按照ITCs含量的多少,选取了凤球唛、川珍和金印3个品牌的青芥辣,以及金葵辣根粉作为研究对象。在蒸馏冷凝开始后,插入醋酸铅吸收液的乳胶管附近开始生成黑色沉淀,溶液呈现棕褐色,但观察不到亚硫酸铅应有的白色,ITCs含量越高,这种现象越明显。蒸馏结束后,锥形瓶内溶液气味呛鼻,上层浮有油状物,应为ITCs,加入盐酸后沉淀大部分溶解,溶液呈轻微棕褐色,滴定完成后,瓶内留有少量不溶性黑色沉淀。滴定数据及计算结果见表2,结果显示大部分产品的二氧化硫残留量超标。排除二氧化硫类添加剂的使用,推测产品中唯一的含硫化合物ITCs可能在蒸馏阶段发生酸性水解反应,其产物或ITCs参与了滴定阶段与碘标液的反应。

表2 含异硫氰酸酯类化合物(ITCs)调味品中二氧化硫含量(GB 5009.34—2016)Table 2 Content of sulfur dioxide in the condiments containing isothiocyanates (ITCs) (GB 5009.34—2016)

2.3 异硫氰酸烯丙酯(AITC)在国标条件下的对照实验

以AITC替代样品做对照实验,蒸馏和滴定过程的现象与前述相同,说明AITC在蒸馏过程中发生了变化,滴定数据结果表明,碘标液的消耗体积与AITC用量成正比关系(见表3)。另外,在使用碘标液滴定AITC的水溶液时,没有观察到明显变化,说明碘单质不能氧化AITC,因此初步判断ITCs在蒸馏阶段发生了水解反应,而水解产物影响了后续的滴定过程。

表3 异硫氰酸烯丙酯(AITC)的对照实验Table 3 Controlled experiment of allyl isothiocyanate (AITC)

表4 异硫氰酸烯丙酯(AITC)水解液的挥发性成分鉴定Table 4 Identification of volatile components in allyl isothiocyanate (AITC) hydrolysate

2.4 异硫氰酸烯丙酯(AITC)在酸性条件下水解产物的分析

酸性条件下水解后的AITC体系,可以明显嗅到臭鸡蛋气味,推测国标滴定法中的黑色沉淀可能是硫化铅,初步判断生成了硫化氢,在AITC水解产物的总离子流色谱图中共检测到23个组分,鉴定出16个成分,见图3。

图3 异硫氰酸烯丙酯(AITC)水解的挥发性产物总离子流色谱图Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile products of allyl isothiocyanate (AITC) hydrolysis

由图4可知,色谱峰1的质谱图的检索匹配度较低。通过对离子碎片的分析,认为应该是一个混合物,质荷比(m/z)39,41,42的碎片有可能是由环丙烷分子裂解产生的,而环丙烷可能来自异硫氰酸烯丙酯分子的烯丙基部分关环。质荷比(m/z)60的碎片比较特殊,排除环丙烷分子的碎片,与其相关的离子并不多,极有可能来自硫化羰分子(SCO),而空气中的氮气、二氧化碳、氧气的分子离子峰恰好与硫化羰分子(SCO)的碎片[CO]+、[CS]+、[S]+对应的质荷比(m/z)28,44,32相同,造成干扰。因此,结合谱图的特征,判断(m/z)60是硫化羰的分子离子峰[SCO]+。

图4 色谱峰1的质谱图Fig.4 Mass spectra of chromatographic peak 1

硫化羰也具有类似硫化氢的臭鸡蛋气味,遇水不稳定,可产生硫化氢[8],这也证实了蒸馏法中的沉淀是硫化铅,在加酸后溶解生成硫化氢,被碘标液氧化滴定,客观上造成了二氧化硫残留量的误差。由于样品基质造成二氧化硫残留量异常的情况已有报道,但多为猜测而缺少直接证据[9-10]。除了硫化羰、二硫化碳和烯丙基硫醇外,烯丙基硫醚和硫杂环类是AITC水解的主要产物,烯丙基硫醚类化合物也是大蒜的特征风味物质[11],多硫醚和多硫杂环类化合物体现了硫原子在反应中容易失去,尤其是检测到以单质硫形式存在的环己硫烷说明了这一点。总之,在酸性水溶液、加热条件下,AITC会发生水解反应。

从理论上分析,对于AITC含量为1%的样品,如果取样5 g,则含 50 mg的AITC,物质的量约为5×10-4mol,假设AITC全部转化为硫化羰,则将消耗浓度为0.001 mol/L的碘标液(1/2 I2)500 mL,说明0.2%的AITC转化为硫化羰会导致国标滴定法检测的二氧化硫残留量超标。

2.5 离子色谱法检测二氧化硫残留值

要证明二氧化硫检测的假阳性,蒸馏液中是否存在亚硫酸根(SO32-)是一个很好的判断依据,因此用离子色谱对蒸馏液进行分析。首先对SO32-和硫酸根(SO42-)的色谱条件进行优化,低浓度的淋洗液和丙酮的加入有助于二者的分开,见图5。尝试用抗坏血酸溶液保护SO32-,效果一般,仍出现SO42-,考虑到SO32-的特殊性,用双氧水将SO32-氧化成SO42-作为检测对象,但双氧水对SO42-出峰有干扰,因此使用碱性的淋洗液作为吸收液,将SO42-作为检测目标。若有SO32-,用碘标液将其氧化成SO42-再分析,见图6。

图5 SO32-与 SO42-的离子色谱图Fig.5 Iron chromatograms of SO32- and SO42-

图6 碘标液氧化前后的样品蒸馏液的离子色谱图Fig.6 Iron chromatograms of sample distillate before and after oxidation of iodine standard solution

得到硫酸根标准曲线方程A=0.127 31C+0.012 94,回归系数R2=0.999 8,见图7。在对青芥辣产品1#、3#、5#,辣根粉11#和芥末油12#的蒸馏液分析中,在1#、5#青芥辣以及12#芥末油中检测到二氧化硫残留量,其测定数值远小于前面的滴定法,3#和11#样品的SO42-色谱峰峰面积小于标准曲线的最小浓度值0.1 μg/mL对应的峰面积0.041 (μS/cm)·min,由公式推算其二氧化硫含量小于2 mg/kg,远低于国家标准50 mg/kg(见表5),这与GB 5009.34—2016滴定法的结果差别非常大,这也验证了AITC对滴定法确实存在影响。

表5 离子色谱法检测的二氧化硫含量Table 5 Content of sulfur dioxide detected by iron chromatography method

图7 硫酸根(SO42-)的标准曲线Fig.7 Standard curve of sulfate (SO42-)

3 结论

青芥辣中的异硫氰酸酯类(ITCs)含量普遍高于原料辣根粉,国产青芥辣中存在不同程度的人工合成异硫氰酸烯丙酯(AITC)的添加。应用GB 5009.34—2016滴定法检测含异硫氰酸酯类(ITCs)调味品中二氧化硫残留量时,会出现超标结果。对照实验证实AITC影响了测定结果,AITC的水解产物分析进一步表明,水解中生成了硫化羰,导致生成硫化氢,被醋酸铅溶液吸收后,与碘标液发生反应,造成二氧化硫检出值偏高。离子色谱法的测定结果表明样品中二氧化硫残留量远低于GB 5009.34—2016滴定法测定值和国标限量值。GB 5009.34—2016滴定法存在两个关键问题;一是空气氛下蒸馏,二氧化硫极易被氧化,造成负误差;二是样品中若存在其他能被碘单质氧化的化合物,或者蒸馏中生成能够被碘单质氧化的化合物,都会造成测量值的正误差。在本研究开展过程中,国家卫生健康委颁布了新的食品二氧化硫测定标准GB 5009.34—2022,并定于2022年12月30日实施。该标准采用充氮蒸馏、酸碱滴定的方法[12]。