葡聚糖添加量对糖基化大豆分离蛋白结构及乳化性的影响

刘琳琳,杨杨,范婧,边鑫,马春敏,郭晓雪,石彦国,张娜

(哈尔滨商业大学 食品工程学院,哈尔滨 150070)

蛋白质中的自由氨基与多糖中的羧基通过共价键形成“蛋白质-多糖偶联物”,该接枝反应在保留蛋白质与多糖初始性能的同时,还可进一步提高蛋白质的功能特性[7],蛋白质是两亲性分子,常用来作为乳化剂和稳定剂,为此大量学者探究糖基化反应对蛋白乳化性的影响,Zhang等[8]以小麦蛋白与葡聚糖进行糖基化反应,发现蛋白的乳化性有所提高,并将其作为脂肪替代品应用于蛋糕中。Li等[9]用乳清分离蛋白与半乳糖生成的糖基化乳清分离蛋白制成的乳液显示出较好的物理稳定性和氧化稳定性,并有增强消化的效果。因此,糖基化在提高蛋白质乳化性方面发挥了重要作用。

因此,本研究利用干热法糖基化反应,以不同质量比的SPI和葡聚糖生成不同接枝度的糖基化蛋白,控制一定的反应温度、湿度及时间,通过测定接枝程度、红外光谱、内源荧光光谱、表面疏水性指数,探究不同质量比下发生糖基化反应后蛋白质出现的结构变化,以及糖基化反应对SPI乳化活性与乳化稳定性的影响,为扩大蛋白质作为乳化剂在调味品行业的应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(SPI):哈高科大豆食品有限责任公司;葡聚糖T10:上海源叶生物科技有限公司;邻苯二甲醛(OPA):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇:北京索莱宝科技有限公司;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS):北京百灵威科技有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-12N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;HWS-50B恒温恒湿培养箱 天津市宏诺仪器有限公司;LAMBDA红外光谱仪 珀金埃尔默股份有限公司;紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;UV5100B高速均质乳化机 上海沪析实业有限公司;F97Pro荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 糖基化大豆蛋白的制备

配制4 g/dL的SPI溶液和1 g/dL的葡聚糖溶液,搅拌一段时间至样品完全水合,将SPI与葡聚糖分别按照1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0的质量比进行复配,经过1 h的搅拌处理,置于-20 ℃冷冻保存,利用冷冻干燥机冻干48 h成粉备用。为获得美拉德前期反应产物,将冻干后的粉末置于恒温恒湿培养箱中反应,控制温度与相对湿度分别为60 ℃和79%,反应24 h后于4 ℃下保存[10]。

1.3.2 接枝度的测定

比较(1)式与(2)式不难看出，钢纤维的含量特征值的变化对钢纤维再生混凝土的轴心抗拉强度和劈裂抗拉强度的增强效果不同，钢纤维对劈裂抗拉强度的增强效果大于对轴心抗拉强度的增强作用。其原因可能是在劈裂抗拉时，受荷端的劈裂面上的钢纤维承受压剪两个方向的作用，相当于对劈拉区施加了约束，形成了边壁效应，随着钢纤维含量特征值的增大，边壁效应的约束作用也同时增大，使得钢纤维再生混凝土的劈裂抗拉强度远大于轴心抗拉强度；而在钢纤维再生混凝土轴心受拉时，钢纤维只受拉力作用，因此轴心抗拉强度增长值没有劈裂抗拉强度增长值明显。

对于糖基化蛋白接枝程度的考察参照Sun等[11]的方法并稍加改动,采用OPA法进行测定,首先配制50 mL OPA溶液,称取40 mg OPA溶于1 mL甲醇溶液中,加入5 g/mL的SDS溶液2.5 mL、0.1 mol/L的硼砂溶液25 mL、β-巯基乙醇100 μL,用蒸馏水定容至50 mL。试管中加入4 mL配制好的OPA溶液与200 μL 2 mg/mL的糖基化蛋白溶液,混匀后置于35 ℃水浴锅中温浴2 min,于340 nm处测定其吸光值A1,空白对照为添加200 μL蒸馏水的OPA试剂,二者吸光值的差值ΔA为自由氨基的净吸光值,接枝度(DG)按照公式(1)进行计算:

DG(%)=(A0-A1)/A0×100。

(1)

1.3.3 红外光谱扫描

参照Yang等[12]的方法并稍作修改,通过傅里叶红外扫描图谱表征糖基化反应前后蛋白质分子的二级结构,称取糖基化反应前后的蛋白1 mg,与溴化钾按1∶150的质量比混合后于研钵中研磨成粉,压制成薄片,在4 000～400 cm-1波数内扫描32次,记录蛋白的红外图谱。

1.3.4 内源荧光光谱扫描

参考Chen等[13]的方法扫描样品的内源荧光光谱,配制糖基化前后的蛋白溶液浓度为1 mg/mL,设置狭缝宽度为5 nm,使蛋白溶液于280 nm波长处激发,扫描其在300～500 nm波长下的发射光谱,记录蛋白的内源荧光光谱。

1.3.5 表面疏水性指数的测定

糖基化产物表面疏水性指数的测定参照Mu等[14]的方法并稍加改动,配制浓度为2 mg/mL的蛋白样品溶液,梯度稀释制作曲线,分别稀释至0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL。试管中倒入4 mL待测样品溶液,加入8 mmol/L的ANS 20 μL后混合均匀,使用荧光分光光度计于15 min内对样品荧光强度进行测定。设定狭缝宽度为5 nm,使待测样品在390 nm波长下激发,扫描其在300～600 nm波长内的发射光谱,糖基化蛋白质的表面疏水性指数可由曲线初始阶段的斜率表示。

1.3.6 乳化性及乳化稳定性测定

乳化性的测定参照Zhang等[15]的方法并稍作修改,量取15 mL 2 mg/mL糖基化前后的大豆蛋白溶液与5 mL大豆油混合,室温下用高速均质乳化机以11 000 g将溶液均质2 min,立即在容器底部取100 μL匀浆,与5 mL 0.1% SDS溶液充分混合,空白对照即为0.1% SDS溶液,测定500 nm波长下的吸光值A0;均质后静置30 min,于同一位置取100 μL匀浆,与5 mL 0.1% SDS溶液充分混合,空白对照仍为0.1% SDS溶液,于500 nm波长下测定吸光值A30。乳化活性指数(EAI)与乳化稳定性指数(ESI)分别按照公式(2)、公式(3)进行计算。

(2)

(3)

式中:n为稀释倍数;C为形成乳液前的蛋白质浓度(g/mL);φ为乳状液中油相的体积分数。

1.4 数据处理

每组实验重复3次,所得数据使用Origin 2018软件进行绘图分析,采用IBM SPSS Statistics 26软件对实验所得数据进行方差分析,P<0.05代表具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 糖基化产物接枝度分析

SPI与葡聚糖之间发生的干热糖基化反应属于美拉德反应的前期反应,接枝度是评价糖基化程度的重要指标。由图1可知,葡聚糖添加量的增加致使接枝程度出现先升高后降低的趋势,蛋白与糖的质量比由1∶0.5增大至1∶2.5,接枝度从26.32%增大到42.68%,这说明蛋白质与葡聚糖分子之间接触的面积增加,体系中参与接枝反应的活性基团增多,SPI中自由氨基可与葡聚糖分子上更多的羰基发生共价结合,促进反应的发生[16]。魏晨[17]以不同质量比的木糖与卵白蛋白发生湿热美拉德反应,研究表明不同的质量比会影响糖基化反应的接枝度,糖占比增大时反应体系中活性位点接触机会增加,促进反应发生,与本文得到的结果相似。当蛋白与糖的质量比达到1∶3.0时,接枝度显著下降至39.68%,可能的原因是糖占比过大,提高了体系的黏度,阻碍了分子间的接触,而接枝后的SPI空间位阻增大,可能发生再聚集,使接枝度下降[18]。

图1 SPI与葡聚糖在不同质量比下糖基化产物的接枝度Fig.1 Degree of grafting of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran注:不同字母表示差异显著(P<0.05),下图同。

2.2 糖基化产物二级结构分析

在1 200～800 cm-1波数范围内,对碳水化合物来说,主要有C-H的弯曲方式及C-C和C-O的拉伸,呈现于图谱中会有波峰产生,糖基化产物对该区域内的吸收强于天然SPI,说明葡聚糖附着于SPI上,二者之间发生了共价结合[20]。糖基化反应发生后,赖氨酸分子中的-NH2官能团可能发生丢失,而美拉德化合物(C-O)、吡嗪类(C-N)和席夫碱(C-N)的量增加,糖基化后的蛋白在碳水化合物区域有较强的吸收,由红外图谱(见图2)可以看出共轭物于1 200～800 cm-1波长内出现了多个新的吸收峰,未经糖基化处理的SPI几乎不存在吸收峰,表明在干热美拉德反应期间,葡聚糖附着在SPI分子上,二者之间发生了共价结合。Zhou等[21]将不同分子量的葡聚糖与SPI按照1∶10的质量比发生糖基化反应,其红外图谱的结果与本实验结果一致。

图2 SPI与葡聚糖在不同质量比下糖基化产物的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrograms of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

2.3 糖基化产物三级结构分析

SPI分子中的色氨酸残基在280 nm波长下激发从而产生荧光,荧光光谱的变化可以用来反映色氨酸微环境的变化,当SPI与葡聚糖发生共价结合时,蛋白本身的结构发生变化,发色基团被掩埋从而导致荧光强度降低[22],由图3中荧光光谱也可以看出,糖基化反应可以明显降低SPI的荧光强度,Hu等在湿热条件下制备了SPI与杏鲍菇多糖的美拉德偶联物,其研究结果也出现了糖基化后蛋白的内源荧光强度低于天然SPI的类似现象[23]。糖基化产物的最强荧光发射峰出现在340 nm左右的波长下,荧光强度随糖占比的增大呈现出先升高后降低的趋势,当蛋白与糖的质量比为1∶2.0时荧光值为75.16,仅次于天然蛋白的89.03,最大发射波长发生小程度的蓝移且峰强度有所减弱,表明糖基化反应对SPI的结构有一定影响,部分色氨酸参与了糖基化反应,而接入的葡聚糖链分子过多,遮蔽了蛋白本身的发射强度,造成峰强度有所降低;同时酪氨酸与色氨酸之间可能会发生疏水相互作用,在蛋白内部形成疏水环境,致使最大发射波长出现蓝移的现象。

图3 SPI与葡聚糖在不同质量比下糖基化产物的内源荧光光谱图Fig.3 Endogenous fluorescence spectrograms of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

2.4 糖基化产物表面疏水特性

ANS荧光探针用于测定糖基化反应前后SPI的表面疏水特性,ANS荧光探针中含有的磺酸基团带有负电,可以与蛋白质中带正电的氨基酸(如赖氨酸等)发生结合,使用荧光分光光度计扫描时可发射出荧光强度,通过测定样品的荧光强度可计算出蛋白质的表面疏水性指数,见图4。

图4 SPI与葡聚糖在不同质量比下糖基化产物的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

对糖基化反应前后的SPI进行外源荧光强度的测定并利用线性关系计算得到其表面疏水性指数,由图4结合ANS荧光光谱图(见图5)可知,天然SPI的表面疏水性指数为64.01,而经过糖基化反应后,大量亲水性羟基引入体系中,增大了体系的亲水性,与天然SPI对比来看,糖基化处理后的蛋白质表面疏水性指数出现显著降低的现象,有提高蛋白质溶解度的可能性[24]。Qu等[25]采用传统和超声辅助湿热法制备了油菜籽分离蛋白(RPI)与葡聚糖偶联物,得到了类似的结果,与RPI相比,糖基化反应降低了偶联物的表面疏水性,由此说明,葡聚糖的接枝反应对SPI的表面疏水性有较强的遮蔽效果,降低了SPI的表面疏水性。可以观察到随着糖占比的增大,复合体系的表面疏水性呈现上升的趋势,可能是因为经过糖基化后的蛋白质,其结构部分伸展,内部疏水基团部分暴露;当蛋白与糖比例达到1∶2.0时,其表面疏水指数达到最高,为34.28,继续增大糖的占比时,可能会因多糖链的遮蔽作用而使表面疏水指数略有降低[26]。

图5 SPI与葡聚糖在不同质量比下糖基化产物的ANS荧光光谱图Fig.5 ANS fluorescence spectrograms of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

2.5 糖基化蛋白的乳化活性及乳化稳定性分析

乳化活性指数(EAI)与乳化稳定性指数(ESI)可以反映出蛋白质形成及稳定乳化体系的能力,可用于衡量蛋白质的乳化性[27]。由图6可知,天然SPI的乳化活性为75.14 m2/g,当蛋白与糖的质量比达到1∶0.5时,乳化活性增大至92.07 m2/g,此时由于接枝反应的发生,蛋白质的球状结构部分伸展,暴露内部的疏水基团,增强蛋白的表面活性,有利于油滴的分散,保持了更好的乳化性[28];随着葡聚糖占比的增加,虽然蛋白质与糖的接触面积进一步增大,糖基化反应逐渐加强,但葡聚糖的过多加入会使体系中引入大量亲水基团,破坏了水油的界面平衡,因此受空间位阻的影响可能会导致乳化性与天然蛋白相比有下降的趋势。乳化稳定性更多受放置时油水界面形成的保护膜的稳定性的影响[29],天然SPI的乳化稳定性为22.55%,经过糖基化反应后的蛋白,其乳化稳定性均高于天然蛋白,说明多糖的黏附性有利于乳化稳定性的增强。过量糖的加入对乳化性不利,但对于乳化稳定性来说却是有利的[30]。

图6 SPI与葡聚糖在不同质量比下糖基化产物的乳化活性指数(EAI)及乳化稳定性指数(ESI)Fig.6 Emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI) of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

3 结论

文章探究了SPI与葡聚糖的质量比不同时发生糖基化反应后蛋白质结构及乳化性的改变,结果表明糖基化反应的发生使蛋白质的二级结构和三级结构改变,葡聚糖接枝到SPI上,导致蛋白表面亲水性基团增多,降低了蛋白的表面疏水性。当SPI与葡聚糖的质量比为1∶2.0时,蛋白质结构改变最大,疏水基团暴露最多,乳化稳定性最高;当SPI与葡聚糖的质量比为1∶0.5时,蛋白的乳化性最好,综上所述,改变葡聚糖的添加量对糖基化产物的结构以及乳化性有不同影响,而蛋白质功能性质的改善对食品工业有重要影响,本研究可为糖基化大豆分离蛋白相关产品在新型乳液、脂肪替代品、生物活性载体等方面的开发提供科学指导。