不同植物精油及精油成分体外抗氧化性能评定

■ 苏翔宇 何剑波 郭升岚 史海涛 郭春华 吕继蓉 余 淼 李建涛

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041；2.四川省动物采食调控工程技术研究中心，四川成都 611130；3.沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 110866)

随着对精油研究的不断深入，有关天然植物精油[1-3]和精油成分[4-6]抗氧化活性的研究层出不穷。精油由醛类、萜烯类、酯类、酸类、醇类、酚类、酮类等具有挥发性的化学分子组成[7]，具有很好的抗氧化效果。有研究报道，百里香精油的化学成分多达85种，酚类物质占大多数[8]。戴冉等[9]报道，牛至油具有高效的抑菌和抗氧化活性。

1，1-二苯基-2-苦基肼（1, 1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl, DPPH）的结构特殊，是一种以氮为中心的有机自由基，稳定性能良好，具有孤电子，能够接受电子或者氢离子，在517 nm 波长处具有较强吸收。当体系中存在抗氧化剂时，会发生电子转移或者氢转移，孤电子被捕捉配对，其醇溶液从深紫色逐渐变为浅黄色[10]，吸收峰减少或者消失，并且吸收峰处的吸光度值降低，从而评价样品的抗氧化能力[11-12]。

在目前报道的文献中，大多是关于植物精油的抗氧化性能研究，较少针对精油成分抗氧化性能进行研究，而对植物精油与精油中主要成分抗氧化性能的对比研究鲜见报道。本研究以牛至油、丁香油、薰衣草油等5 种植物精油和丁香酚、香芹酚、肉桂醛等20 种精油成分作为研究对象，这20种精油成分包含3种酚类物质、1 种烯类物质、4 种醇类物质、2 种醚类物质、7 种醛类物质和3种酯类物质，采用清除DPPH自由基的方法测定抗氧化性能；然后再从中筛选出清除DPPH 自由基能力在90%以上的植物精油或精油成分，以及生产中常用的3 种精油成分（柠檬醛、肉桂醛、柠檬烯），以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作为阳性对照物，测定其IC50值（即抗氧化剂对DPPH 自由基清除率达50%的质量浓度，IC50值越低表示抗氧化能力越强）[13]。探究植物精油与精油成分的抗氧化性能，为其作为替抗的绿色添加剂在动物饲料中的开发应用提供基础数据，这对于促进畜禽健康养殖具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DPPH，购自上海某公司；5种植物精油和20种精油成分及抗氧化剂BHT，由成都某有限公司馈赠（见表1）。

表1 5种植物精油和20种精油成分的基本信息

1.2 试验设备与仪器

赛默飞全波长酶标仪（Multiskan sky）、岛津电子分析天平（ATY224）、96孔TC细胞培养板、移液器。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂的配制与保存

精油乙醇溶液的配制：称取精油20 g，使用无水乙醇作为溶剂，溶解定容到100 mL 容量瓶中，定容后作为母液待用，4 ℃冷藏保存，使用时逐级稀释。

DPPH溶液的配制（需现用现配）：准确称取DPPH试剂5 mg，使用无水乙醇溶解，并定容于100 mL 容量瓶中，低温下避光保存，DPPH 反应溶液的浓度为12.68×10-3mmol/mL。

1.3.2 精油清除DPPH自由基能力的测定

① 取0.5 mL供试精油乙醇溶液及BHT乙醇溶液于离心管中，均加入新配制的DPPH 溶液0.5 mL，均匀混合避光反应27 min 后，常温下3 000 r/min 离心3 min；取200 μL 反应溶液加入96 孔板中，以酶标仪检测517 nm 处吸光度值（A2），吸光度值越低表示对DPPH自由基的清除能力越强。

② 取0.5 mL供试精油乙醇溶液及BHT乙醇溶液，与等体积的无水乙醇均匀混合避光反应27 min后，常温下3 000 r/min 离心3 min；取200 μL 反应溶液加入96孔板中，以酶标仪检测517 nm处吸光度值（A1）。

③ 取0.5 mL 无水乙醇，与等体积的DPPH 溶液均匀混合避光反应27 min 后，常温下3 000 r/min离心3 min；取200 μL 反应溶液加入96 孔板，以酶标仪检测517 nm 处吸光度值（A0）。以上试验重复3 次，求得清除率的平均值[14-15]。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A2-A1）/A0]×100

式中：A0——0.5 mL 无水乙醇+0.5 mL DPPH 乙醇溶液的吸光度值；

A1——0.5 mL 样品+0.5 mL 无水乙醇的吸光度值，以消除样品本身颜色的影响[16]；

A2——0.5 mL 样品+0.5 mL DPPH 乙醇溶液的吸光值。

1.4 数据统计与分析

所有数据采用Excel 软件进行整理统计，并计算出样品对DPPH 自由基清除率的平均值，然后采用Excel 软件中的函数公式计算清除率的标准偏差，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 精油清除DPPH自由基能力的初步测定结果

对5种植物精油和20种精油成分进行初步筛选，测定其清除DPPH自由基的能力，结果如表2所示。

表2 5种植物精油和20种精油成分清除DPPH自由基能力(浓度200 mg/mL)

由表2 可知，当浓度为200 mg/mL 时，5 种植物精油（牛至油、丁香油、薰衣草油、肉桂油和缬草油）、3种酚类精油成分（丁香酚、百里香酚、香芹酚），以及松油醇、香草醛和BHT 的清除率均在90%以上，具有较强的抗氧化作用，而其余物质抗氧化性能较弱。因此这5 种植物精油和5 种精油成分值得进一步探究，确定为复测对象。

2.2 精油清除DPPH自由基能力的复测结果

将清除率在90%以上的5 种植物精油（牛至油、丁香油、薰衣草油、肉桂油、缬草油）和5 种精油成分（丁香酚、百里香酚、香芹酚、松油醇、香草醛）以及BHT进一步稀释后进行复测。取200 mg/mL 的精油乙醇10 mL溶液至100 mL容量瓶，最终得到20 mg/mL的精油乙醇溶液，测定其对DPPH 自由基的清除能力，结果如表3所示。

表3 5种植物精油和5种精油成分清除DPPH自由基能力（浓度20 mg/mL）

由表3 可知，当供试植物精油及精油成分浓度为20 mg/mL 时，3 种植物精油（牛至油、丁香油、薰衣草油）和4 种精油成分（丁香酚、百里香酚、香芹酚、香草醛）以及BHT 对DPPH 自由基的清除率仍达90%以上，表现出较高的抗氧化性能，而肉桂油、缬草油、松油醇对DPPH 自由基的清除能力分别为48.90%、38.51%、43.01%。

2.3 3 种植物精油和4 种精油成分清除DPPH 自由基的IC50值

为便于比较，将清除率达到90%以上的3 种植物精油和4 种精油成分，以及表2 中清除率较低但生产中常用的3 种精油成分（柠檬醛、肉桂醛、柠檬烯）进行IC50值的测定，进一步研究其抗氧化能力。

将浓度在20 mg/mL时，清除DPPH自由基能力在90%以上的3 种植物精油（牛至油、丁香油、薰衣草油）和4 种精油成分（丁香酚、百里香酚、香芹酚、香草醛），以及清除DPPH 自由基能力低于90%，但在生产中常用的3 种精油成分（柠檬醛、肉桂醛、柠檬烯），配制为不同质量浓度的溶液，进行IC50值的测定。以清除率作为y轴，精油质量浓度作为x轴绘制清除自由基的拟合曲线，计算其IC50值，结果见图1和表4。

图1 植物精油、精油成分和BHT对DPPH的清除率的曲线

表4 植物精油和精油成分IC50值

如图1 所示，所测试的3 种植物精油和7 种精油成分与BHT 都随着浓度的增加，清除率逐渐升高，DPPH 自由基溶液褪色程度越大，具体表现为溶液颜色由深紫色变为浅黄色，代表样品抗氧化性能越强。

根据供试精油与BHT在不同浓度下对DPPH自由基清除率的大小绘制相关曲线，从曲线中得到供试精油和BHT的半清除浓度值IC50。IC50值越小表明该物质清除DPPH自由基的能力越强，抗氧化能性能也越强。

如表4 所示，丁香酚、丁香油、薰衣草油、BHT、牛至油、百里香酚、香草醛、香芹酚、柠檬醛、肉桂醛、柠檬烯的IC50值分别为0.008 4、0.012 7、0.358 0、0.641 5、0.684 4、0.970 9、1.148 3、1.478 6、48.799 2、120.365 9、213.184 2 mg/mL。从IC50值的大小可以发现，丁香酚、丁香油、薰衣草油、BHT、牛至油、百里香酚、香草醛、香芹酚，均表现出较好的抗氧化性能，且丁香酚、丁香油、薰衣草油的抗氧化活性分别比BHT 高76.37、50.51、1.79 倍；但柠檬醛、肉桂醛、柠檬烯的抗氧化活性相对较弱。因此，以上植物精油、精油成分及对照BHT的抗氧化活性由强到弱依次为：丁香酚＞丁香油＞薰衣草油＞BHT＞牛至油＞百里香酚＞香草醛＞香芹酚＞柠檬醛＞肉桂醛＞柠檬烯。

3 讨论

目前，精油体外抗氧化性能测定的方法种类繁多，主要以化学法和体外细胞培养法为主。DPPH 自由基凭借其结构简单、性质较为稳定、反应条件容易控制，成为评定物质抗氧化性能的首选试剂[17]。本试验采用DPPH 法测定5 种植物精油和20 种精油成分的体外抗氧化性能，当浓度为200 mg/mL 时5 种植物精油（牛至油、丁香油、薰衣草油、肉桂油和缬草油）、3 种酚类（丁香酚、百里香酚、香芹酚）、1 种醛类（香草醛）和1 种醇类精油成分（松油醇）对自由基的清除率在90%以上。当进一步稀释到浓度为20 mg/mL 时，有3 种植物精油（牛至油、丁香油和薰衣草油）、3 种酚类（丁香酚、百里香酚、香芹酚）和1 种醛类精油成分（香草醛）的清除率仍在90%以上。

从IC50值来看，丁香酚的抗氧化性能最好（IC50=0.008 4 mg/mL），其次为丁香油（IC50=0.012 7 mg/mL），薰衣草油、BHT、牛至油、百里香酚、香草醛、香芹酚的抗的抗氧化性能相差不大（IC50=0.358 0～1.478 6 mg/mL）。而畜牧生产中配制复方精油常用的柠檬醛、肉桂醛和柠檬烯的体外抗氧化性能很弱（IC50=48.799 2～213.184 2 mg/mL）。总体来看，精油成分中以酚类化合物的抗氧化性能最强，这与许雯菁等[18]研究结果相似。

丁香油的主要成分为丁香酚、乙酰基丁香酚（乙酸丁香酯）、乙位石竹烯等，其中丁香酚含量高达64%～85%[19]。有研究报道，通过清除DPPH 自由基发现，随着浓度的提高，丁香酚清除DPPH 自由基的能力逐渐增强，表现出了较好的抗氧化能力[20]。索氏提取和水蒸气蒸馏所得的丁香油清除DPPH 自由基的能力均强于阳性对照物VC 和BHT[21]。本研究也得到类似结果，由于丁香油中丁香酚含量高，因此其抗氧化活性是5种精油中最强的，也优于BHT。

牛至油的主要成分为香芹酚、百里香酚、对伞花烃，其中香芹酚和百里香酚占78%～82%[22-23]。有研究表明，牛至油的体外抗氧化性能优于BHT；而本研究中牛至油的体外抗氧化性能略低于BHT，与上述结果有一定差异，可能是由于植物精油的来源不同所致。因为植物精油的成分及其含量受产地、提取植物的部位和成熟度、提取方法等的影响而有很大差异[24]。

薰衣草油主要含有黄酮类物质，有研究报道黄酮类化合物能够清除氧自由基，减少自由基对动物机体的损害，提高机体的抗氧化活性[25]。李紫薇等[26]报道，随着浓度的增加薰衣草黄酮提取物清除DPPH 自由基的能力增强，且当浓度为10 mg/mL 时清除能力相当于VC的91.5%。

肉桂油中主要化学成分是肉桂醛，占比在70%～85%[27]，本试验检出肉桂醛的清除率较低（45.55%，表2），这可能是肉桂油的抗氧化性能也较差的原因。缬草油的主要成分为乙酸龙脑酯（39.660%）、莰烯（20.007%）、α-蒎烯（11.972%）、乙酸桃金娘烯酯（8.047%）、柠檬烯（3.105%）等[28]，本试验检出酯类和烯类的抗氧化性能均较低（表2），这可能也是缬草油的抗氧化性低的原因

根据清除DPPH 自由基的IC50值，本试验所测植物精油精油成分的体外抗氧化能力强弱依次为：丁香酚＞丁香油＞薰衣草油＞BHT＞牛至油＞百里香酚＞香草醛＞香芹酚＞柠檬醛＞肉桂醛＞柠檬烯。丁香酚、丁香油和薰衣草油的抗氧化能力分别是BHT 的76.37、50.51、1.79 倍，而牛至油、百里香酚、香草醛和香芹酚的抗氧化能力是BHT 的93.73%、66.07%、55.87%和43.39%。王新伟等[29]研究了牛至油及其精油成分清除DPPH 自由的能力表现，结果为BHT＞肉桂醛＞香芹酚＞牛至油＞柠檬醛。本研究结果与前人研究结果有所差异，可能是精油抗氧化效果与产地以及精油提取方式、部位等有关[30-31]。

4 结论

① 植物精油和精油成分浓度为200 mg/mL 时，25 种供试精油中牛至油、丁香油、薰衣草油、肉桂油、缬草油、丁香酚、百里香酚、香芹酚、松油醇、香草醛（香兰素）以及BHT 对DPPH 自由基的清除能力均在90%以上，表现出较好的抗氧化性能；生产中常用的柠檬醛、肉桂醛、柠檬烯三种精油清除DPPH 的能力相对较低，分别为84.79%、45.55%、36.21%。

② 植物精油和精油成分浓度为20 mg/mL 时，牛至油、丁香油、薰衣草油、丁香酚、百里香酚、香芹酚、香草醛以及BHT 对DPPH 自由基的清除率仍在90%以上，但肉桂油、缬草油、松油醇的清除率分别为48.90%、38.51%、43.01%。

③ 以BHT 为对照，根据IC50值，几种精油和精油成分的抗氧化性能强弱依次为：丁香酚＞丁香油＞薰衣草油＞BHT＞牛至油＞百里香酚＞香草醛＞香芹酚＞柠檬醛＞肉桂醛＞柠檬烯。丁香酚、丁香油和薰衣草油的抗氧化能力分别是BHT的76.37、50.51、1.79倍。