共轭亚油酸对梅花鹿鹿茸脂肪酸代谢组的影响

2023-09-11赵海平李光玉

饲料工业 2023年17期

■ 鲍坤赵海平李光玉*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112）

传统动物营养学主要研究的内容包括养分消化吸收、养分的功效、饲料的营养价值评定以及动物的营养需要量等。受后基因时代的到来以及科学技术的不断进步的影响，宏观层次的营养信息传递机制、营养物质调节机制、环境对机体营养代谢影响的机制以及动物机体自我营养调控功能等多个方面的研究，正成为动物营养学研究的新领域[1]。内源性代谢物的综合评估是通过代谢组学来体现的，通过代谢组学可以实现来自生物样品的代谢物及其相关代谢途径的分离、检测、表征和定量，以此来反映生物机体的营养状况、营养代谢变化甚至一些疾病的发展程度等都可以通过代谢组学来体现。钟伟等[2]研究了饲粮脂肪水平对3 岁生茸期梅花鹿营养物质消化率、血清生化指标及瘤胃液挥发性脂肪酸组成的影响，研究认为饲喂脂肪水平为2%的饲粮，可满足3 岁生茸期梅花鹿生产需求。此项研究确定了梅花鹿日粮中脂肪的适宜添加水平，同时也为共轭亚油酸（conjugated linoleic acids，CLA）在梅花鹿日粮中的添加水平提供了数据参考。

CLA 是一种功能强大的脂肪酸，CLA 进入动物体后具体的代谢产物差异研究较少，尤其是在作为经济价值比较大的梅花鹿上，相关的研究并未有人开展。在我国，梅花鹿是一种重要的特种反刍家畜，可以提供鹿茸等重要的中药产品。鹿茸是一种非常珍贵的中药，鹿茸的品质是影响鹿茸价格的主要因素。梅花鹿在2020 年进入《国家畜禽遗传资源目录》后，梅花鹿产业发展迎来了新的历史机遇。研究如何增加鹿茸产量，提高鹿茸品质，增加养殖者的经济效益，为社会提供优质鹿茸，具有十分重要的社会意义。因此，本研究探讨了饲粮添加不同水平CLA后，梅花鹿鹿茸中脂肪酸代谢产物的变化情况，明确了鹿饲粮中CLA适宜的添加水平，该研究结果将为CLA在提高鹿茸品质和梅花鹿精细化饲养中的应用提供科学理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

动物试验在中国农业科学院特产研究所茸鹿实验基地完成。采用单因素试验设计，选择16 头平均体重为（40.25±2.38）kg 的1 岁雄性梅花鹿，随机分为4组，每组4头鹿，组间体重差异不显著（P＞0.05）。对照组（G0 组）饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加0.25%（G1组）、0.50%（G2组）和1.00%（G3 组）的CLA。CLA 纯度为99.99%，主要成分为顺-10 和反-12-CLA。试验期80 d。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础，%）

1.2 鹿茸采集

试验现场技术人员检验鹿茸生长成熟并达到收茸标准后，适时收取鲜鹿茸。

1.3 标品配制及样品处理

1.3.1 标准品配制

参照胡扬清[3]的方法，并对方法进行了改进。11个混合标准浓度梯度分别为0.5、1、5、10、25、50、100、250、500、1 000、2 500 μg/mL，正己烷作为溶剂配制而成。母液于-80 ℃条件下保存，使用时的工作标准液要现配现用。37 种脂肪酸甲酯的标准品中各物质信息及浓度占比情况如表2所示。

表2 脂肪酸标准品组成信息

1.3.2 样品前处理

参照胡扬清[3]的方法处理鹿茸。

1.3.3 GC-MS检测

色谱条件如表3所示。质谱条件为电子轰击电离（EI）源，SIM 扫描模式，电子能量70 eV。

表3 色谱条件

1.4 统计分析

数据以“平均数±标准差”的形式表示。采用SAS（2008）软件中的Duncan’s方法进行多重比较和显著性分析，其中P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 总离子流色谱图（TIC）

从图1可以看出，共识别到34种脂肪酸。未检测出C11：0 和C4：0，将两组未分离的同分异构体C18：1、C18：1T、C18：2 及C18：2TT 的浓度进行合并计算。由于脂肪酸标品与内标分离明显，表明按照此方法建立的检测条件良好。

图1 色谱图（上：空白；中：标准品；下：样本）

2.1.2 标准曲线

通过气质联用检测脂肪酸标准液的系列浓度，横坐标表示检测的标准品浓度，纵坐标表示标准品与内标的峰面积比值。表4 列出了检测到的各脂肪酸的线性回归方程，相关系数符合标准。

表4 34种脂肪酸标准品的线性回归方程、精密度、重复性

2.1.3 精密度和重复性

精密度以RSD 表示，将混标浓度为250 μg/mL 的标准样品连续进样五次，以此结果来计算精密度。从检测到的精密度结果来看，仪器的精密度良好。表4列出了详细的精密度结果。

按“1.3.2 样本前处理”的步骤，重复处理样本，计算重复性。表4列出了详细的重复性检测结果。

2.2 鹿茸脂肪酸定量检测结果

根据建立的样品前处理及仪器分析方法，对所有鹿茸样品进行定量分析。检测结果如表5所示。

表5 鹿茸脂肪酸定量检测结果（μg/g）

检测了鹿茸中37 种脂肪酸的含量，丁酸（C4：0）和十一酸（C11：0）未检测出，其余各脂肪酸均有检出。在检测出的脂肪酸中，中链脂肪酸（碳链中碳原子6～12 个）含量各组间差异不显著（P＞0.05），且含量变化规律不明显；对长链脂肪酸而言，鹿茸中大部分脂肪酸含量不受饲粮添加CLA 的影响（P＞0.05），仅有棕榈油酸、硬脂酸、油酸、反式油酸、亚油酸和反式亚油酸受饲粮中添加CLA 的显著影响，由于添加CLA 后，鹿茸中的以上脂肪酸含量均显著高于对照组（P＜0.05），其中棕榈油酸、硬脂酸、油酸和亚油酸含量达到差异极显著水平（P＜0.01），而当添加量为0.50%时，各组鹿茸中脂肪酸含量最高；添加CLA后，二十碳二烯酸和花生四烯酸含量亦明显增加（P＜0.05），尤以0.50%添加组含量最高。其余各长链脂肪酸含量差异不显著（P＞0.05），但基本上可以看出明显的变化规律，即添加CLA 后，鹿茸中长链脂肪酸的含量除二十碳烯酸、二十碳三烯酸外均有所增加。

2.3 对鹿茸脂肪酸组成的影响

由表6 可以看出，饲粮添加CLA 后鹿茸中多不饱和脂肪酸（PUFA）和饱和脂肪酸（SFA）所占比例均有所提高，其中G2 组与对照组相比达到差异显著水平（P＜0.05）；单不饱和脂肪酸（MUFA）所占比例下降，其中G2组与对照组相比达到差异显著水平（P＜0.05）。

表6 饲粮CLA水平对鹿茸脂肪酸组成的影响（%）

3 讨论

化学分析法、平衡试验、消化代谢试验以及饲养试验技术等传统的动物营养分析手段，已不能满足人们在动物营养研究领域的技术需求[4-5]。复杂的生物反应过程以及代谢通路中的代谢规律，可以通过代谢组技术来揭示，这种方法可以有效地开发潜在的营养评定生物标记物，是动物营养研究的一个新领域[6-7]。靶向代谢组学（targeted metabolomics）主要应用的技术手段为气质联用（GC-MS）技术，其显著特点是特异性强、检测灵敏度高和定量准确等。GC-MS 技术适用于检测分子质量比较小的代谢物，标准谱的图库比较完整、分辨率高以及分离效果好是GC-MS 技术的主要优点。分析成功的关键因素是准确度、高通量和可靠性。

在动物营养领域，靶向代谢组学技术已经得到了较大范围的推广和应用，代谢组学可以研究营养干预对内源性代谢物变化的影响，通过调整营养干预促使动物达到最佳健康状况。动物体内正常的代谢平衡失调，有时是由于营养物质摄入不足或过多引起的，动物营养研究中必须要面对的问题是考量和制定动物对营养的需要量标准[8]。在单胃动物上，肖英平[9]研究了早期断奶仔猪饲粮中补充谷氨酰胺对血清代谢物的影响，应用GC-MS 代谢组学技术研究了谷氨酰胺对仔猪生长发育中的作用机理，同时发现了仔猪在早期断奶下碳水化合物、氨基酸和脂质的代谢途径。基于GC-MS 代谢组学技术，Zhou 等[10]研究观察发现，猪长期采食蛋白含量低的饲粮后，显著影响了异戊酸酯和异丁酸酯的浓度，表明这2 种物质可能为猪的蛋白质需要量的确定提供参考依据。以上试验表明，构建基于代谢标识物的营养需要量评估模型，通过代谢组学技术可以对动物营养物质的需要量进行辅助评价和科学描述。

关于鹿茸中脂肪酸的代谢的研究，主要集中在近五年。刘文媛[11]首次对商业上划分的鹿茸4 个区段（蜡片、粉片、蜂片、骨片）进行了代谢组学研究，通过代谢组学手段研究将认为，鹿茸4 个区段的高表达量代谢物主要是脂肪酸，脂肪酸是鹿茸4 个相邻区段的主要差异代谢物。王燕华等[12]进行了不同加工方式及不同部位区段脂肪酸的气相色谱法分析，研究发现，排血鹿茸中的脂肪酸含量高于带血鹿茸，冻干加工的鹿茸中的脂肪酸含量高于煮炸处理鹿茸；鹿茸中饱和脂肪酸以棕榈酸和硬脂酸为主，单不饱和脂肪酸主要为油酸，多不饱和脂肪酸组分中亚油酸、亚麻酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸的量较高，没有检出含量较低的短链脂肪酸和中链脂肪酸。刘松鑫等[13]利用代谢组技术，研究了梅花鹿头茬鹿茸和二茬鹿茸中脂肪酸的含量情况，研究结果表明2 种鹿茸中均检测到25 种脂肪酸，其含量在5.89～3 964.85 mg/kg。头茬鹿茸、二茬鹿茸中脂肪酸的总量分别为13.01、11.64 g/kg，头茬鹿茸中脂肪酸含量显著高于二茬鹿茸脂肪酸的含量（P＜0.05）。头茬茸和二茬茸中SFA 主要成分相似，均以棕榈酸和硬脂酸为主，约占脂肪酸总量的30.15%、17.73%；MUFA 主要成分亦相似，均以油酸（C18：1，cis-9）为主，约占脂肪酸总量的20.27%；PUFA 均以亚油酸（C18：2，cis-9，12）、花生四烯酸（C20：4，cis-5，8，11，14）为主，分别占脂肪酸总量的7.09%、6.16%。刘松鑫等[14]对不同形态梅花鹿茸中脂肪酸含量进行了检测，结果表明鹿茸中的脂肪酸组成具有一定的规律。毛桃茸、二杠茸、三杈茸含有的脂肪酸种类有所差异，三杈鹿茸脂肪酸种类较多。三种鹿茸中饱和脂肪酸均以C16：0 和C18：0 为主，单不饱和脂肪酸均以C18：1，cis-9为主，多不饱和脂肪酸均以C18∶2，cis-9，12、C20：4，cis-5，8，11，14为主。

本试验利用靶向代谢组技术检测了毛桃鹿茸中37 种脂肪酸的含量，其中丁酸和十一酸未检测出，其余35 种脂肪酸均有检出。从检测结果可以看出，相对于长链脂肪酸，中链脂肪酸含量比较低。对长链脂肪酸而言，鹿茸中仅有棕榈油酸、硬脂酸、油酸、反式油酸、亚油酸和反式亚油酸受饲粮中添加CLA 的显著影响，由于添加CLA 后，鹿茸中的以上脂肪酸含量均极显著高于对照组（P＜0.01），其中棕榈油酸、硬脂酸、油酸和亚油酸含量达到差异极显著水平（P＜0.01），而添加量为0.5%时，各组鹿茸中脂肪酸含量最高；添加CLA 后，二十碳二烯酸和花生四烯酸含量亦明显增加（P＜0.05），尤以0.5%添加组含量最高。其余各长链脂肪酸含量差异不显著（P＞0.05）。此结果与刘松鑫等[14]研究结果稍有不同，主要体现在检测出的脂肪酸种类有所增加，这说明梅花鹿饲粮中添加CLA 能够增加鹿茸中脂肪酸的种类，进而提升鹿茸的品质。

同时统计了鹿茸中MUFA、PUFA 和SFA 所占比例，统计结果表明饲粮添加CLA 后鹿茸中PUFA 和SFA 所占比例均有所提高，MUFA 所占比例下降。在其他动物中的多项研究表明，饲粮添加CLA能够改变脂肪酸在动物组织或产品中所占的比例。Ahn 等[15]研究了CLA 对白莱航蛋鸡蛋黄脂肪酸组成的影响，研究结果表明随着饲粮CLA 含量的提高，蛋黄中的SFA 的含量逐渐增加，而MUFA 含量逐渐降低。其他学者也发现类似结果[16-17]。以上试验结果均可以说明饲粮添加CLA 确实具有改变动物产品中SFA 与MUFA 比例的生理效应。CLA 如何抑制MUFA 合成的具体机制目前还不清楚。Choi 等[18]在小鼠上的试验结果表明，硬脂酞辅酶A 去饱和酶（SCD）基因的表达显著地受到反-10，顺-12 CLA 的抑制，使得SCD 的活性降低。而硬脂酰辅酶A 去饱和酶是体内SFA 向MUFA 转化的关键酶。猜测可能是由于CLA 降低了SCD 的生物活性，SFA 向MUFA 的转化受阻，使SFA在鹿茸内蓄积，含量升高。但是在鹿科动物方面，几乎未见到类似报道。CLA 是否能够抑制鹿茸中SCD的活性，进而影响了SFA 与MUFA 的比例，仍需要进一步研究和探讨。

研究表明，饲粮添加CLA 对动物产品中的PUFA和SFA 的沉积有促进作用。齐明江等[19]研究了饲粮中添加CLA 对滩羊二毛期羔羊肉品质及不同部位脂肪酸含量及种类的影响，研究认为CLA对肌肉脂肪酸组成有改善作用，提高了羊尾、背长肌中PUFA 和SFA的含量。而尚秀国[17]在蛋鸡上的研究表明，随着饲粮中CLA 添加量的提高，蛋黄中多PUFA 的总量呈线性提高的趋势。本试验的研究结果与以上研究结果相似。饲粮添加CLA 促进了PUFA 和SFA 在鹿茸中的沉积。据报道，PUFA 具有降血脂、预防心脑血管疾病、促进生长发育、抗氧化、抗衰老等功效。试验鹿茸中测得的PUFA 有11 种，主要以C18：2 和C18：2TT为主，含量占PUFA 总量的比重较大，作为鹿茸中的主要营养成分之一，其含量的沉积对鹿茸品质的提升有积极的促进作用，尤以0.5% CLA 添加组的效果最为明显。