氮添加对马尾松人工林土壤团聚体氮矿化及土壤酶活性的影响

陈 天,程瑞梅, 2,*,王丽君,肖文发, 2,沈雅飞, 2,孙鹏飞,张 萌,曾立雄, 2

1 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 国家林业和草原局森林生态环境重点实验室,北京 100091 2 南京林业大学 南方现代林业协同创新中心,南京 210037

自然状态下超过99 %的土壤氮以有机态存在,有机氮的矿化速率直接影响土壤氮的周转速率和生产力水平[1]。大气氮沉降的增加对植物净初级生产力提高有一定的贡献,但随着氮输入的增加,就会产生氮损失增加和土壤酸化等现象,继而导致生物多样性丧失等后果[2—3]。研究表明,氮沉降会影响土壤氮矿化水平。例如,人工模拟氮沉降处理可以显著促进森林土壤净氮矿化量,但这种促进作用会随着处理时间的延长而减弱[4];也有研究表示氮沉降对森林土壤氮矿化的促进不显著[5],有的地区还会出现氮沉降抑制土壤氮矿化的现象[6—7]。团聚体是土壤结构的基本单元,表层土中的有机氮基本存在于各级的团聚体之中,团聚体的有机氮矿化整合结果是土壤有机氮矿化的实质[8]。不同粒径的团聚体有机氮矿化速率存在差异。如Cai等发现微团聚体(<250 μm)由于具有较小粒径,可以结合更多有机物,因此具有较高的氮矿化速率;而较大粒径的团聚体由于有机物分解空间受制等原因,导致氮矿化速率为显著低于微团聚体[9];但是李奕等报道指出土壤有机氮矿化主要取决于土壤氮含量,而与土壤团聚体无直接关系[10]。总体来说,对于团聚体粒径大小与有机氮矿化的关系尚无统一结论。

土壤氮矿化是一个复杂的过程,涉及生物因素(土壤酶等)和非生物因素(土壤养分、pH等),在氮转化的每一阶段均需要专一的生物酶的参与。如薛立等[11]发现,在一定层面上,有机氮的矿化速率可以用脲酶(UE)活性来表征。在针对亚热带地区森林的研究中发现,氮沉降显著提高了脲酶和酸性磷酸酶(AP)等土壤氮磷循环关键过程中的水解酶的活性,在作用时间达到三年时增幅更加显著[12];而在温带森林中,土壤N-乙酰-β-D-葡糖苷酶(NAG)和过氧化物酶(POD)的活性在氮沉降作用下却受到了抑制[13—15],这说明大气氮沉降除了通过土壤氮储量直接影响土壤氮矿化,还可以通过改变土壤酶活性对氮矿化产生影响。因此,要分析和预测区域氮沉降对森林土壤氮素动态的影响,需要结合当地土壤环境条件对氮沉降的响应。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区域位于湖北省秭归县茅坪镇泗溪村,地理坐标为30°78′30″N,110°94′13″E,属于亚热带大陆性季风气候,年平均气温14—22℃,年平均降水量1400 mm。研究区内马尾松为20世纪80年代飞播造林,样地内林分分布均匀,平均坡度20°,海拔 800—850 m。土壤类型主要有黄棕壤、紫色土等,土壤深度约40 cm。研究区内的植被以天然植被为主,林下伴生灌木植物有:茶(Camelliasinensis)、细齿叶柃(Euryanitida)等;伴生草本植物:鱼腥草(Houttuyniacordata)和千里光(Senecioscandens)等。

1.2 试验设计与样品采集

根据当地的大气氮沉降背景值(30 kg N hm-2a-1),以NH4NO3为外源N源,通过定位添加的方式,设置4个不同的氮处理,分别是:①N0,氮添加量为0 kg N hm-2a-1,此为对照处理;②N30,氮添加量为30 kg N hm-2a-1;③N60,氮添加量为60 kg N hm-2a-1;④N90,氮添加量为90 kg N hm-2a-1。2018年7月,在马尾松林内拉设3个20 m×20 m的样方,样方完全随机区组设计。每个样方中布设4个土壤条件相近的3 m×3 m 的样点,用于4 个氮添加处理的使用。将NH4NO3的年施用量平均分成6 等份,从2018年8月开始,每2 个月对样点进行一次氮添加处理,对照组则喷洒相同量的清水。2021年8月,在每个样方中去除表面凋落物,并随机选取30 个采样点,用直径5 cm,高10 cm的PVC管采取样点中的原状土,用保鲜膜封存,置于冷藏箱中运回实验室4 ℃冰箱保存。在实验室将PVC管中土样小心取出,顺着土壤缝隙将土壤掰成8 mm以下的小块,根据Elliott[18]提出的筛分法将土壤团聚体进行分级,得到大团聚体(>2000 μm)、小团聚体(250—2000 μm)和微团聚体(<250 μm) 共3个粒径[19]。土壤分别用于土壤酶活性检测、土壤 pH等土壤性质检测以及后期矿化实验。

1.3 测定指标与方法

1.3.1土壤检测方法

将筛出的部分团聚体自然风干后分别过2 mm和0.149 mm的筛子,用于土壤基本性质的检测。使用电极法测定土壤 pH (水土比为2.5∶1.0,pH211 酸度计);高温外热重铬酸钾氧化-容重法测定土壤有机质(SOM),凯氏定氮法测定全氮(TN),盐酸、氟化铵浸提-钼锑抗比色法测定速效磷(aP),乙酸铵浸提-火焰光度法法测定速效钾(aK)。土壤氨态氮和硝态氮含量使用流动分析仪完成检测。

1.3.2土壤氮矿化速率计算

使用纯水将团聚体含水量调节至田间最大持水量的60 %,置于25 ℃的培养箱中预培养7 d,以恢复样品中的微生物水平。预培养结束后,取部分团聚体放入冰箱保存,用于矿化实验前氨态氮和硝态氮含量的测定。称取相当于20 g干土重量的团聚体置于350 mL梅森瓶中,用无菌透气封口膜封住瓶口,在培养箱中于25 ℃中培养28 d,期间每48 h采用称重法调节团聚体水分。培养结束后,将梅森瓶中的土壤转移至4℃冰箱保存,用于矿化实验后的土壤氨态氮和硝态氮含量测定。土壤氮矿化速率的计算[7]:

R氨=(NB氨-NA氨) /d

R硝=(NB硝-NA硝) /d

Nmin=(NB氨+NB硝-NA氨-NA硝) /d

1.3.3土壤酶活的表征和测定

相对于初中学生而言，除了心理的成长，身体的成长也格外的重要。相对于身体成长而言，合理健康的饮食和生活习惯起到了至关重要的作用。但是在中学时期的学生中不乏会出现一些减肥或者贪吃的现状，造成学生身高和体重严重不符，再者因为网络的普及促使着学生养成了晚睡晚起的坏习惯，这对于学生的身体健康成长都有着极大的危害。所以在课堂教学活动中，教师也要能够通过知识的讲解，培养学生养成健康的饮食和生活习惯，这对于中学生的身体健康成长有着重要的影响。

土壤使用上海通蔚生物科技有限公司生产的试剂盒(微量法)处理,酶活使用赛默飞世尔(上海)仪器有限公司生产的Multiskan FC型酶标仪测定。

1.4 数据分析

采用Excel 2016进行数据整理,使用SPSS 19.0和Canoco for Windows 4.5对数据进行统计分析。采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)和 Duncan 多重比较对不同氮添加水平下各指标进行显著性检验,检验水平P= 0.05。图表中数据的表达形式为“平均值 ± 标准差”。使用Origin 2021完成绘图。

2 结果与分析

2.1 氮添加对团聚体理化性质的影响

由表1可得,马尾松人工林土壤整体呈酸性,氮添加处理未对土壤速效钾产生显著影响。N30和N60提高了土壤有机质(SOM)含量,土壤全氮(TN)含量随氮添加未显示出显著的累加效应,N90低了SOM、TN和速效磷(aP)的含量。微团聚体的SOM和TN含量整体最高。

表1 氮添加对团聚体理化性质影响

2.2 氮添加对土壤团聚体氮矿化速率的影响

表2 矿化实验前后团聚体的无机氮含量

如图1所示,土壤平均净氨化速率整体低于土壤净硝化速率。氮添加处理显著抑制了大团聚体和小团聚体的净氨化速率(P<0.05),微团聚体净氨化速率在N90下达到最高。各粒径团聚体土壤净硝化速率均在N90处理下最高。大团聚体的净硝化速率整体低于小团聚体和微团聚体(P<0.05)。由图1可得,大团聚体的净氮矿化速率均低于小团聚体和微团聚体(P<0.05)。

图1 氮添加对土壤氮矿化速率的影响Fig.1 Effect of N additions on N mineralization rates of aggregatesN0:对照处理,氮添加量为0 kg N hm-2 a-1;N30:氮添加量30 kg N hm-2 a-1;N60:氮添加量60 kg N hm-2 a-1;N90:氮添加量90 kg N hm-2 a-1

2.3 氮添加对土壤团聚体酶活的影响

如图2所示为氮添加下团聚体中脲酶(UE)、过氧化物酶(POD)、硝酸还原酶(NR)、酸性磷酸酶(AP)以及N-乙酰-β-D-葡糖苷酶(NAG)的活性变化。POD在大团聚体中整体活性最低,NR在微团聚体中活性整体最低,在小团聚体中活性整体最高。氮添加处理降低了小团聚体中的POD活性,提高了微团聚体POD的活性。N60和N90提高了大团聚体和小团聚体中NR的活性(P<0.05)。与N0相比,微团聚体的AP和NAG活性在氮添加处理后出现了下降(P<0.05)。

图2 氮添加对土壤酶活的影响Fig.2 Effect of N addition on enzyme activities of aggregates

2.4 线性相关分析

图3 土壤理化性质与氮矿化速率的相关性Fig.3 Correlation between physical and chemical properties on aggregates and N mineralization rates.SOM:有机质,Soil organic matter;TN:土壤全氮,Soil total nitrogen;aP:土壤速效磷,Available phosphorus;aK:土壤速效钾,Available 矿化量;矿化量; r2值后标注“*”表示在0.05检验水平上相关性显著,r值后标注“**”表示在0.01检验水平上相关性显著; 由图4可得,土壤理化性质对所测的5种土壤酶活性均存在不同程度影响。土壤SOM、TN与AP和NAG之间的正相关达到显著水平。土壤UE活性与土壤以及aP与UE、POD之间存在正相关(P<0.05);土壤aK与POD存在负相关(P<0.05),与NR存在正相关(P<0.01)

图4 土壤理化性质与土壤酶的相关性Fig.4 Correlation between physical and chemical properties on aggregates enzymes activities

3 讨论

3.1 土壤理化性质和氮矿化量对氮添加的响应

3.2 土壤酶活对氮添加的响应

脲酶(UE)是土壤重要的水解酶之一,在土壤氮循环中起到非常重要作用,以往研究多认为氮沉降可以提高土壤UE的活性[26]。实验发现,氮添加量与土壤UE活性之间没有显著的相关,是由于氮添加解除了土壤无机氮的限制,继而土壤微生物UE的分泌的需求减少所致[24]。而微团聚体中UE活性相对较高,某种程度上可能会增加氨气的挥发量,造成环境温室气体增加,存在无机氮利用率较低的风险[27]。硝酸还原酶(NR)是催化反硝化作用的第一阶段的生物酶,是生态系统中氮循环过程中一个重要的调节酶和限速酶[28]。N30和N60处理下NR活性较N0处理差异不显著,这是包括马尾松在内的植物和土壤微生物等加快了对土壤氮的吸收利用,减弱了土壤氮循环过程中的反硝化强度[28];N90处理下土壤的活性较高,反映了该处理下土壤反硝化过程加快,也加重了土壤氮除了淋溶途径之外的流失,继而最终导致土壤TN在N90处理下较其他3个处理没有显著提高。在团聚体层面上,微团聚体中TN含量较低,同时具有较高UE活性,与其他两个粒径相比,微团聚体的反硝化途径受到了一定程度的抑制[29]。N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)活性在氮添加后活性降低,表明氮的增加可能使土壤中该水解过程速率降低,或者土壤微生物对水解产物的需求出现了下降,结合氮添加提高了大团聚体和小团聚体的酸性磷酸酶(AP)的活性,说明土壤酶活调节依照一般的自然经济学原则:即随着土壤氮添加量的增加,土壤氮限制逐渐解除,与此同时对磷的需求增加,因此这两种水解酶的活性对氮添加的响应出现相反的趋势[17, 30]。

过氧化物酶(POD)是氧化还原反应中一个非常重要的限制酶,负责将木质素、芳香族化合物等分解为醌和酚类等简单有机物,直接影响土壤中难分解有机物的分解[31]。氮添加显著的抑制了大团聚体和小团聚体中的POD活性,这是由于氮输入抑制了与其合成和分泌有关的真菌(如白腐真菌、丛枝菌根真菌)的数量,从而使POD活性下降[32];微团聚体中POD的活性的增加,意味着氮添加会加速微团聚体中腐殖质的形成[31]。

3.3 氮添加下土壤酶活性与氮矿化的关系

如图5和图6所示为4种氮添加处理下土壤酶活性与土壤氮矿化速率RDA分析和相关性分析。UE对土壤氨化速率、土壤硝化速率、土壤氮净矿化速率均存在促进效应,这与以往的实验结果一致[33—34]。这是由于UE是水解尿素的专项生物酶,继而影响整体土壤净氮转化速率;但是在复杂的土壤环境中,有机氮的转化同时存在氮的矿化(增加矿机氮)和矿质氮被同化形成有机氮(减少矿质氮),两条路径的博弈结果最终表现为土壤有机氮矿化量的变化[35]。氮本身作为土壤的限制因素之一,UE活性的提高带来土壤可利用性氮的提高,对两条有机氮转化路径的激发效应也同时存在,因此在统计学上UE活性与土壤氨化速率、土壤硝化速率和土壤氮净矿化速率未达到显著水平[36—37]。NAG与土壤净硝化速率存在显著正相关,这与张锦新等人的研究一致[38]。从经济学角度分析,马尾松人工林土壤有机氮向无机氮转化过程中,POD的活性与无机氮储量会呈现负相关。POD将木质素、芳香族化合物等氧化为如醌和酚类等,多种土壤微生物有机会大量繁殖,会消耗部分无机氮来满足生产[39—40];另外,过氧化物酶具有清除过氧化物质的催化效果,将减轻土壤系统中的过氧化毒害程度,可能在此过程中提高了催化反硝化过程的相关酶的活性,这需要进一步实验探究。

图5 土壤酶活性与土壤氮矿化速率RDA分析图 Fig.5 Redundancy analysis of aggregates enzyme activities and N mineralization ratesRDA分析:冗余分析,Redundancy analysis;UE:土壤脲酶,Urease;POD:过氧化物酶,Peroxidase;NR:硝酸还原酶,Nitrate reductase;AP:酸性磷酸酶,Acid phosphatase;NAG:N-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶,N-acetyl-β-D-glucosaminidase

图6 土壤氮矿化速率与土壤酶活性相关性分析Fig.6 Correlation analysis between aggregates N mineralization rates and enzyme activities

4 结论

(1) 土壤SOM和TN含量在高氮处理下显著降低。氮添加增加了土壤aP限制的风险,在小团聚体中表现最为显著。此外,氮添加降低了小团聚体的POD以及微团聚体中的AP和NAG的活性。

(2) 团聚体的物理结构是保护有机氮的重要机制。土壤净氮矿化主要贡献者是土壤净硝化反应;土壤净氮转化效率在N90处理下最高。

(3) 氮添加下SOM和TN的增加可能导致土壤aP限制,而aK的增加会降低这种风险。此外,氮添加影响土壤酶活性,可能导致土壤氮流失和氨气释放增加的风险,并导致小团聚体中含碳难分解有机物的分解受限。氮添加下多种土壤酶活性综合影响了土壤氮矿化。其中UE、NAG与净氨化、净硝化和净氮转化之间分别存在显著正相关,POD与净硝化和净氮转化效率之间存在显著负相关。