基于电子鼻和气质联用识别不同工艺的俄色茶

易宇文，何 莲，邓 静, ，胡金祥，彭毅秦，乔明锋，蔡雪梅，朱开宪，吴华昌，雷 敏

（1.四川旅游学院，四川成都 610100；2.炉霍雪域俄色有限责任公司，四川甘孜藏族自治州 626500）

变叶海棠（Malus toringoides（Rehd.） Hughes）为蔷薇科苹果属落叶灌木，大多分布在海拔3000～3500 m 的高海拔地区，是中国特有植物资源，在四川、西藏等高海拔地区有分布。以变叶海棠叶为原料，按制茶工艺制成的饮品，当地人称为俄色茶。藏医和现代医学均认为俄色茶具有治疗消化不良，降血压、血脂[1-3]等功效。近年来通过质谱、核磁、液相、气相和IRIS Intrepid II XSP 等分析发现俄色茶主要成分为二氢查耳酮、黄酮、氨基酸、多糖、脂肪酸等[4-6]。由此可见，俄色茶保健价值极高。

茶叶香气的形成既与所含香气物质（占茶叶质量的0.01%～0.05%）有关[7]，又与后序加工工艺存在极大联系[8]。茶叶香气形成的4 条途径[9]是影响茶叶香气差异的重要因素。有研究表明，茶叶香气对茶叶品质的贡献率在25%～40%[9-10]之间。郭洪伟等[11]分析红茶和绿茶的主要香气成分表明：醇类和醛类物质是红茶的主要挥发性物质；醇类和酯类是绿茶的主要挥发性物质。乔小燕等[12]的研究表明康砖茶主要挥发性物质为酮类、醛类和醇类。以变叶海棠叶为原料，通过不同加工工艺形成了俄色红茶、绿茶和康砖茶，其整体香味轮廓是否存在差异以及具体香气物质的差异未见相关报道。

茶叶中的香气物质分子量小、沸点低、挥发性强。选择有效香气检测方法至关重要。电子鼻是一种快速识别样品整体气味轮廓的仪器，其检测结果具有客观性、重复性、可视性等优点，但无法判断样品之间气味差异的具体物质。捕集阱自动顶空（trap head space）具有样品处理简单，气味物质自动萃取、富集和进样，方便快捷等特点。气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是分离、鉴定物质的有效工具。电子鼻和GC-MS 在茶叶整体气味轮廓及具体物质的鉴定领域有广泛应用。陆晨浩等[13]发现发芽3 天的黑麦茶香气与未发芽的差异明显。邵淑贤等[14]研究表明利用黄观音乌龙茶的5 种主要香气成分所构建SVM 判别模型，其识别不同产地的黄观音乌龙茶的识别率为100%。WANG 等[15]研究表明，不同工艺制备的茶叶其香气和含量差异大，挥发性物质含量结合聚类分析能够准确分类。另外，正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一种有监督的分析方法，其通过去除变量的数据变异，将分离信息集中在一个主成分中，使模型变得简单且易于解释。

本研究以不同工艺的俄色茶为研究对象，采用电子鼻、HS- Trap- GC-MS 技术结合OPLS-DA、ROAV、差异性热图，识别不同工艺的俄色茶整体气味轮廓，鉴定俄色茶挥发性物质，分析俄色茶主要香气物质及差异，旨在比较不同工艺条件下俄色茶气味异同，探明不同工艺条件下俄色茶气味特点，为俄色茶风味研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

俄色茶样品 由四川炉霍雪域俄色有限公司提供，样品信息见表1，样品加工方法参见文献[16]。取四个不同年份（2019、2020、2021 和2022 年）的俄色红茶、绿茶和康砖茶各3 份，将样品分别混匀，研磨成粉，过40 目筛，备用。

表1 样品信息表Table 1 Sample information

FOX 4000 电子鼻 Alpha MOS 公司；Clarus 680气相色谱仪、Elite-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱、Clarus SQ8T 质谱仪、HST40 捕集阱顶空进样器 美国珀金埃尔默公司；DFY-400C 高速粉碎机温岭市林大机械有限公司；ME203E 电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限责任公司；6CR-40 型揉捻机、6CFJ-1 发酵机、6CH-12 烘干机 信阳一鼎茶业科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品工艺及参数 俄色红茶制备工艺及参数：采摘（高山变叶海棠嫩芽）、萎凋（加温50 ℃萎凋，至含水量60%左右）、揉捻（40 型揉捻机按轻、重、轻进行冷揉，至成条率90%）、发酵（发酵机温度35 ℃，相对湿度80%，发酵时间6 h）、干燥（烘焙100 ℃，时间45 min）、筛选、检验、包装。

俄色绿茶制备工艺及参数：采摘（高山变叶海棠嫩芽）、摊青（摊青床，厚度2～5 cm，通微风，15 min翻动一次，至鲜叶含水量70%）、杀青（温度为270 ℃，至含水量为60%）、揉捻（40 型揉捻机按轻、重、轻进行冷揉，至成条率90%）、烘干（温度100 ℃，至含量水为6%）、筛选 、检验、包装。

俄色康砖茶制备工艺参数：采摘（高山变叶海棠嫩芽或碎嫩芽）、杀青（温度为270 ℃，至含水量为55%）、揉捻（40 型揉捻机按轻、重、轻进行冷揉，揉捻叶细胞破坏率为80%）、渥堆（堆高80 cm，室温25 ℃，茶坯含水量35%，渥堆时间为15 d）、干燥（烘焙200 ℃，时间15 min）、筛拼（蒸压成型）、干燥（压饼成型后的俄色茶置于干燥环境，自然干燥）、检验、包装。

1.2.2 电子鼻检测 样品前处理：取2.0 g 俄色茶粉装入洁净的10 mL 顶空瓶，用顶空盖、垫密封，备用。

电子鼻检测条件：样品在孵化器（70 ℃）内孵化5 min，进样量500 μL，进样速度500 μL/s，手动进样。每个样品检测120 s，检测器清洁180 s。每个样品检测20 次，取10 次稳定（依据其在主成分二维图中的集中程度）数据进行分析。

1.2.3 GC-MS 检测 样品前处理：取俄色茶粉4.0 g装入20 mL 顶空瓶，用GC-MS 专用瓶盖密封，装入自动进样器。备用。

萃取及进样条件：萃取温度70 ℃，进样针温度75 ℃，传输线温度80 ℃，萃取时间1800 s，干吹120 s，解析10 s，顶空瓶加压/释压120 s，捕集阱保持240 s，捕集阱循环4 次。

气相条件[17]：载气（99.999% He），流速1.0 mL/min。起始温度30 ℃，保持3 min，然后以2 ℃/min 升至160 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保留3 min。

质谱条件：EI 离子源，电子轰击能量为70 eV，离子源温度230 ℃，电子倍增电压1650 V；质量扫描范围：45～450 m/z；标准调谐文件。

定性、定量：首先去除柱流失的含硅类物质，然后选取正反匹配度均大于700（最大999）, 参考NIST 2011 谱库，同时结合质谱图进行定性。以相对峰面积计算相对含量。

检测结果有效性选择：每个样品检测5 次，仅取3 次都能检测到的物质作为有效结果。

1.2.4 相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）的计算 相对气味活度值（ROAV）是一种结合阈值判定化合物重要性的方法，其原理及计算方法见参考文献[18-19]。

式中：C 表示某物质的相对百分含量；T 表示该物质的呈香阈值。

1.3 数据处理

OPLS-DA 分析、绘图、预测变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）：SIMCA14.1软件。平均值及标准偏差（±SD）：SPSS 25。电子鼻雷达图、差异性热图：数据归一化处理及制图采用origin 2021。

2 结果与分析

2.1 电子鼻分析俄色茶整体气味轮廓

表2 是电子鼻检测3 种工艺的俄色茶传感器响应数据，经OPLS-DA 分析的结果。表中可以看出，传感器（LY2/LG、LY2/G 、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT、P30/2、TA/2）的响应值差异不显著（P＞0.05），其他传感器差异则显著（P＜0.05）。从VIP 值可知，LY2/LG、LY2/AA、T40/2 这3 根传感器的值大于1，说明其在识别样品中贡献比其他传感器大；3 个样品在T40/2 传感器上，差异显著且VIP 值大于1，说明传感器T40/2 在识别俄色茶中有重要作用。

表2 不同工艺俄色茶电子鼻传感器响应值Table 2 Response value of Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea electronic nose sensor in different processes

图1 是电子鼻检测结果的传感器数据绘制的雷达图。图中可以看出红茶样品在所有传感器（除LY2 型）上的响应值均高于其他样品。有研究表明，电子鼻能快速识别不同香气的茶叶，茶叶香气越浓郁，其电子鼻传感器的响应值越高[20]。说明红茶样品香气浓郁，其次是绿茶，康砖茶香气最次。

图1 电子鼻雷达图Fig.1 Electronic nose radar diagram

图2 是样品经OPLS-DA 分析的散点图。3 个样品分布在不同区域，均无交叉，这既能说明工艺对俄色茶香气形成的影响大，又能说明电子鼻能够有效区分样品且重复性良好。3 个样品自变量拟合指数R2X= 0.991，因变量指数R2Y=0.964；模型预测指数Q2=0.957，其预测能力为95.70%。一般认为自变量和因变量拟合指数大于0.5 即可接受[21]。

图2 电子鼻OPLS-DA 分析Fig.2 OPLS-DA analysis of electronic nose

图3 是判别模型经过300 次（最大999）置换检验的结果。图中，所有方形和圆形点横坐标均在大于0 的位置，Q2回归线与Y 轴的交点小于0。这说明模型拟合效果好，模型验证有效。由此可见，通过电子鼻结合OPLS-DA 数据模型来区分不同工艺的俄色茶效果良好。

图3 电子鼻模型交叉验证结果Fig.3 Cross validation results of electronic nose model

2.2 不同工艺的俄色茶挥发性物质差异分析

GC-MS 对俄色茶挥发物质的定性及定量检测结果见表3，分类见表4。3 种工艺的俄色茶共鉴定出98 种挥发性物质，红茶、绿茶和康砖茶分别鉴定出52、52 和52 种；相对含量分别为94.01%、90.20%和92.98%。其中包括醛类24 种、酯类5 种、醇类16 种、烃类21 种、酮类13 种、呋喃4 种、其他物质15 种。醛类、酯类、醇类（康砖茶除外）、烃类（康砖茶）是样品主要挥发性物质。共有物质10 种：异戊醛、辛醛、2-甲基庚醛、庚醛、三甲氧基酯、癸烷、2,2-二甲基癸烷、2,2,4,4-四甲基辛烷、4-甲基-3-丁烯-2-酮、2-乙基呋喃。这些被检测到的物质、种类、共有物质及含量的差异，初步反映了3 种工艺条件下俄色茶气味的差异。

表3 俄色茶挥发性物质差异分析Table 3 Difference analysis of volatile substances in Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea

续表3

表4 俄色茶挥发性物质种类及相对含量Table 4 Types and relative content of volatile substances in Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea

醛类物质生成途径比较复杂，一般认为醛类物质是微生物发酵时，不同氨基酸在对应酶作用下生成不同的醛类物质[22]；醛类物质也可通过脂肪酸过氧化及降解产生或者是某些不稳定醇被氧化而成为醛类物质[23]。醛类物质是俄色茶主要挥发性物质，其含量在21.33%～48.62%之间。异戊醛（沸点92～93 ℃）是三个样品主要共有物质，且含量较高（10.87%、4.75%、10.94%），在发酵茶中，特别是红茶[19]和黑茶[24]中比较常见。异丁醛（沸点94 ℃）是俄色红茶独有的主要挥发性物质，含量为13.48%。李慧等[19]认为异戊醛、异丁醛是构成红茶果香、甜香、焦糖香的主体香气物质。因此可认为异丁醛是红茶区别于绿茶和康砖茶的关键物质。已醛是红茶和绿茶检测到的共有物质，含量均大于7.50%，在康砖茶中未检出。已醛在大多数茶叶中均有检出，其含量在红茶中相对较高[19]。3-甲基-2-丁烯醛（异戊烯醛）是康砖茶中检出的含量很高的物质（11.32%），是一种具有脂肪香味的物质[25]；其在六大茶类[26-27]以及一些六大茶类以外的茶（如各种保健茶）中含量均不高[25,28]，而俄色康砖茶含量高，但无阈值相关数据，需要进一步研究。

酯类香气形成[29]可能是氨基酸在脱氨、脱羧而氧化形成酸和醇，最后经过酯合成酶作用，从而形成酯香。酯类物质在三个样品中种类较少，但含量高（17.41%～36.53%）。三甲氧基酯在三个样品中的含量均高于16%，是含量最高物质，但无其气味和阈值相关数据。三甲氧基酯在金牡丹[30]及铁观音[31]中有检出。甲酸甲酯是一种具有甜香、青果香气的物质，仅在俄色绿茶中有检出，且含量较高（3.42%）。

茶叶中醇类物质的形成：蛋白质水解成氨基酸以及氨基酸与酶、邻醌等作用生成醇类物质[32]。醇类物质含量在5.43%～14.09%之间，通常具有花、果气息。红茶和绿茶共有物质3 种，环丁基甲醇、青叶醇是含量较高的物质（＞1%）。红茶与康砖茶共有物质2 种，为苯甲醇，3-戊烯-2-醇（＞1.50%）。绿茶与康砖茶共有物质1 种：顺-4-环戊烯-1,3-二醇。

三个样品均检测到烃类物质，其含量均大于8%。康砖茶烃类物质含量最高（19.30%）。烃类物质中以烷烃为主，一般认为烷烃类物质阈值较高[33]，其可能对康砖茶香气形成贡献较小。

2.3 俄色茶ROAV 分析及差异比较

为探明3 种工艺的俄色茶中各挥发性组分对样品整体香气贡献，实验结合挥发性物质的气味阈值、香气描述以及香气类型，对52 种（能检索到阈值）挥发性物质进行分析，结果见表5。红茶、绿茶、康砖茶分别检测到28、35、19 种有阈值的香气物质。根据香气描述和香气类型：果香（17 个）、腥香（8 个）、焙烤香（6 个）、异香（4 个）、花香（3 个）、焦香（2 个）、迷香（1 个）、奶香（1 个）、肉香（1 个）、焦糖香（1 个）、烟香（1 个）；果香、腥香和焙烤香是样品主要香气。依据香气类型和ROAV 值，果香（12160768）、甜香焦糖香（8986444）、腥香（596098）对红茶气味的形成相对贡献较大；对红茶香气贡献最大的10 种物质是异戊醛、异丁醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、己醛、庚醛、异戊醇、苯乙醛、活性戊醇；果香（6297561）、花香（1317535）、焙烤香（285808）对绿茶气味的形成相对贡献较大；对绿茶贡献最大的10 种物质是异戊醛、壬醛、辛醛、庚醛、己醛、2-正戊基呋喃、苯乙醛、癸醛、萘、2-己烯醛；果香（10129749）、花香（3001136）、腥香（1918858）对康砖茶气味的形成贡献相对较大；对康砖茶香气贡献最大的10 种香气物质是异戊醛、辛醛、3-己烯醛、庚醛、2-甲基萘、异戊醇、2-甲基戊醛、戊醛、D-柠檬烯、3-戊烯-2-醇。果香类物质对俄色茶气味的形成贡献大，醛、醇是俄色茶香气的主要来源。异戊醛、辛醛、庚醛是3 种俄色茶共有主要香气物质，且异戊醛是含量最高（有气味）的物质。可以推测异戊醛可能是俄色茶关键香气物质。

表5 俄色茶香气成分的ROAV 分析Table 5 ROAV analysis of aroma components of Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea

2.4 挥发性物质差异性分析

根据表4 的分类，选取每个样品中每类含量前5 的物质[35]进行差异性热图分析，其结果见图4。由图4 各种物质丰度可知，三甲氧基酯、异戊醛、2-乙基呋喃是3 个样品的主要共有挥发性物质。除共有物之外，红茶主要挥发性物质是异丁醛、己醛、环丁基甲醇、2,2-二甲基癸烷、叶醇、2-甲基庚醛、2-乙基呋喃；绿茶主要挥发性物质是己醛、环丁基甲醇、2-乙基呋喃、甲基环氧丙烷、甲酸甲酯、环丙基甲基甲醇；康砖茶主要挥发性物质为2-乙基呋喃、trans-2-甲基戊二烯、L-乳酸乙酯、甲基环氧丙烷、3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯醛、3-甲基壬烷、苯乙基甲基亚砜、五-3,4-二烯醛、2-羟基-2-环戊烯-1-酮、辛醛、异佛尔酮。

图4 挥发性物质差异性热图分析Fig.4 Differential thermogram analysis of volatile substances

2,2-二甲基癸烷、叶醇、2-甲基庚醛、甲基环氧丙烷、甲酸甲酯、环丙基甲基甲醇的丰度反应了红茶、绿茶的差异。己醛、环丁基甲醇、trans-2-甲基戊二烯、L-乳酸乙酯、3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯醛、3-甲基壬烷、苯乙基甲基亚砜、五-3,4-二烯醛、2-羟基-2-环戊烯-1-酮、辛醛、异佛尔酮的丰度反应了绿茶、康砖茶的差异。红茶、康砖茶的差异与绿茶、康砖茶类似，仅在绿茶、康砖茶差异的基础上增加了叶醇、甲基环氧丙烷。纵观整个热图， 3 个样品差异明显。

3 结论

实验以俄色茶为研究对象，通过电子鼻和GCMS 分析，结合OPLS-DA、ROAV、差异性热图等方法对俄色茶整体气味轮廓进行识别和鉴定具体挥发性物质。电子鼻雷达图及OPLS-DA 分析表明不同工艺的俄色茶差异明显。GC-MS 检测表明三种处理方式分别鉴定出52、52 和52 种，共计98 种挥发性物质；醛类、酯类、烃类是俄色茶主要挥发性物质，醇类是红茶、绿茶主要挥发性物质；醛类、酯类、烃类和醇类的含量差异是导致不同工艺俄色茶香气异同的主要原因。ROAV 值结合香气类型分析表明：果香、甜香和腥香对红茶香气的形成贡献较大，果香、花香、焙烤香对绿茶香气的形成贡献较大，果香、花香和腥香对康砖茶香气的形成贡献较大；果香对俄色茶香气的形成相对贡献较大，异戊醛可能是俄色茶的关键香气物质。差异性热图分析表明三甲氧基酯、异戊醛、2-乙基呋喃是3 个样品主要共有挥发性物质。

三甲氧基酯是俄色茶含量最高的共有物质，3-甲基-2-丁烯醛（有气味的相关报道）是康砖茶中含量较高的物质（11.32%），但目前没有其气味及阈值相关报道，故无法判断其在俄色茶中具体作用。下一步课题组将结合GC-O 对其进行进一步研究。