超声退火法制备抗性淀粉及其理化性质分析

曾徐睿，刘良忠, ，齐 婷，朱 哲

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023；2.武汉隆丰园生物科技有限公司，湖北武汉 430040）

抗性淀粉（resistant starch，RS）是一种兼具可溶性纤维与不可溶性膳食纤维特性的淀粉，其在人体内无法被消化，且相对普通膳食纤维具有更高的生理活性[1]。抗性淀粉被分为五大类，其中Ⅲ型抗性淀粉（resistant starch Ⅲ，RS3）是指回生淀粉，因其良好的功能和安全特性，被广泛用于食品工业，并已成为一个研究热点。

现今，制备抗性淀粉的方法有很多，研究人员多采用物理、化学及酶法，或单一或多重的方式制备得到高含量的抗性淀粉。其中物理法以其安全、环保的优势被广泛使用在食品工业中。超声波处理（ultrasonic treatment）是一种高效、环保和安全的新兴技术，可以通过改变淀粉的非晶态和结晶结构域来影响淀粉的理化和功能性质[2]。Ding 等[3]研究了超声处理对回生淀粉消化性的影响，结果表明，在超声波处理下，分子重排发生，容易形成新的有序结构，其缓慢消化特性和抗消化特性增加，从而提高了抗性淀粉含量。退火处理（annealing treatment）是一种物理性的淀粉改性技术，它是指在过量的水中对悬浮的淀粉进行一段时间的加热处理。这个过程会导致淀粉链的重组，从而形成紧凑的、物理上不可渗透的结晶结构。这些结构使消化酶无法催化水解糖苷键，从而产生了抗性淀粉[4]。Chung 等[5]研究了退火对玉米抗性淀粉的影响，结果显示经退火处理的玉米抗性淀粉含量从4.6%提升到了8.0%。Marboh 等[6]经退火处理豆科植物块茎淀粉，使其抗性淀粉含量从11.3%提升至17.36%。Babu 等[7]探究超声波退火双重处理谷子淀粉对其功能和结构的影响，结果表明超声退火双重改性谷子淀粉使得抗性淀粉含量显著提升至45.59%。综上所述，超声退火工艺以其安全、便利的优势，在抗性淀粉工业化生产应用中拥有广阔的前景。

糯米淀粉（waxy rice starch）因含有较高比例的支链淀粉，所以具有难回生，消化快等特点[8]。近年来，对糯性淀粉进行物理、化学以及酶法改性处理，多是为了降低其消化率，满足人们对健康饮食的追求。脱支酶处理糯性淀粉会使支链淀粉分子被切割成直链淀粉分子，直链淀粉分子会重新结合生成RS3[9-11]。目前，研究人员大多选用直链淀粉含量较高的天然淀粉或人工育种提取的高直链淀粉，成本高且不易得。因此，选择以糯米淀粉为原料，在酶法脱支的基础上获取更多直链淀粉，在一定程度上可以降低原料成本，也可以为后续制备抗性淀粉提供便利。本研究以经普鲁兰酶脱支预处理的糯米淀粉为原料，采用超声退火法制备糯米抗性淀粉。运用单因素实验和响应面分析法获得制备抗性淀粉的最佳工艺条件，并对所制备的抗性淀粉进行理化性质分析，为糯米抗性淀粉工业化生产及其在功能性食品中的应用提供理论支持。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

糯米淀粉 无锡金农生物科技有限公司；醋酸钠、乙酸、氢氧化钾、无水乙醇等 国药集团化学试剂有限公司；普鲁兰酶Promozyme D6（4000 NPUN/g）诺维信（中国）生物技术有限公司；K-RSTAR 抗性淀粉试剂盒 爱尔兰Megazyme 公司。

HZ150L 恒温培养摇床 武汉瑞华仪器设备有限责任公司；7200 型分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；230HT 超声波处理仪 深圳洁拓超声波清洗设备有限公司；ZEISS Gemini 300 扫描电镜

德国卡尔蔡司公司；Frontier 傅里叶红外光谱仪美国铂金埃尔默公司；Q2000 差示扫描量热仪 美国TA 仪器公司；SmartLab SE X 射线衍射仪 日本株式会社理学。

1.2 实验方法

1.2.1 抗性淀粉制备方法 将适量糯米淀粉用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制成18.5%的淀粉乳溶液，沸水浴糊化30 min 后，在121 ℃下高压30 min。随后，在淀粉糊中加入普鲁兰酶（160 NPUN/g）并在60 ℃下脱支24 h。沸水浴灭酶完成后放入45 ℃贮藏24 h[12]，然后转移至45 ℃烘箱中烘干，获得脱支回生糯米淀粉样品。取适量上述脱支回生糯米淀粉样品，配制成一定浓度的淀粉乳，放入超声波处理仪中处理一段时间，接着在一定温度的恒温摇床中进行退火处理。超声退火完成后的淀粉乳在45 ℃下保存24 h。45 ℃烘干、粉碎、过筛获得超声退火糯米RS3。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 水分含量对糯米RS3含量的影响 称取5 g脱支回生淀粉样品，在超声功率为120 W 的条件下，固定超声时间20 min，退火温度55 ℃，退火时间24 h，调节水分含量为50%、60%、70%、80%、90%，研究水分含量对超声退火糯米RS3得率的影响。

1.2.2.2 超声时间对糯米RS3含量的影响 称取5 g脱支回生淀粉样品，在超声功率为120 W 的条件下，固定水分含量70%，退火温度55 ℃，退火时间24 h，设置超声时间为0、10、20、30、40 min，研究超声时间对超声退火糯米RS3得率的影响。

1.2.2.3 退火温度对糯米RS3含量的影响 称取5 g脱支回生淀粉样品，在超声功率为120 W 的条件下，固定水分含量70%，超声时间20 min，退火时间24 h，研究退火温度50、55、60、65、70 ℃对超声退火糯米RS3得率的影响。

1.2.2.4 退火时间对糯米RS3含量的影响 称取5 g脱支回生淀粉样品，在超声功率为120 W 的条件下，固定水分含量70%，超声时间20 min，退火温度55 ℃，研究退火时间8、16、24、32、40 h 对超声退火糯米RS3得率的影响。

1.2.3 响应面法优化制备糯米RS3工艺条件 在单因素实验的基础上，通过Box-Behnken 试验设计，选定水分含量、超声时间、退火温度、退火时间4 个因素作为目标变量，抗性淀粉含量为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，试验因素及水平如表1 所示。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 抗性淀粉含量测定 抗性淀粉含量测定依据AOAC2002.02 检测。计算公式如下：

抗性淀粉含量＞10%：

式中：ΔE表示相对于空白试剂的吸光度值；F 表示从吸光度值到微克的转换（F=100/100 μg D-葡萄糖的GOPOD 吸光度值）；W 表示分析样本的干重。

1.2.5 理化性质分析

1.2.5.1 透明度 参考牛博文等[13]的方法，配制1%（w/v）的淀粉乳溶液，在沸水中加热搅拌15 min，自然冷却。在620 nm 下，以蒸馏水为空白对照设其透光率为100%，检测淀粉糊的透光率。

1.2.5.2 溶解度和膨胀能力 参考许美娟[14]的方法稍作修改，配制2%（w/v）的淀粉乳，分别置于50、60、70、80、90 ℃水浴中搅拌30 min，自然冷却。4500 r/min 离心15 min。将上清液于105 ℃烘干并恒重记为m1，沉淀物称重记为m2，计算公式如下：

式中：m1为上清液中溶出物质量，g；W 表示样品干重，g；m2表示离心沉淀物质量，g。

1.2.5.3 扫描电镜观察微观结构 取适量样品粘到导电胶上，并喷金。使用ZEISS Gemini 300 扫描电子显微镜拍摄样品形貌，拍摄时加速电压为3 kV，放大1000 和5000 倍。

1.2.5.4 红外光谱分析 参考吴怡瑾等[15]并稍作修改，采用傅里叶红外光谱仪进行测定。分辨率为 4 cm-1，扫描次数为32 次，采集范围为400～4000 cm-1。

1.2.5.5 热稳定性分析 称取3 mg 淀粉样品置于铝坩埚内并加入9 μL 去离子水，密封后，在室温下平衡24 h，采用差示扫描量热仪进行检测，测定温度范围20～130 ℃；升温速率为10 ℃/min。

1.2.5.6 晶体结构分析 将粉末样品置于载玻片上，使用X 射线衍射仪进行测试，测试范围为5°～50°，扫描速度为5 °/min，光源为Cu-Kα射线，管电压是40 kV，电流是40 mA。

1.3 数据处理

做3 次平行试验，采用Origin 8.5、SPSS Statistics 19 与Design Expert 8.0.6 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 水分含量对糯米RS3含量的影响 如图1 所示，当其他工艺条件不变时，水分含量在50%～80%时，抗性淀粉含量相对较高。随着水分含量不断增加，抗性淀粉含量呈现先增加再减少的趋势，其中当水分含量为70%时，糯米抗性淀粉含量达到最大峰值，为43.50%，原因是淀粉材料结晶生成抗性淀粉是直链淀粉分子通过氢键结合形成双螺旋结构而成，淀粉乳的水分含量越低，其粘度越高，结晶受到限制，故形成的抗性淀粉含量偏低[16]。水分含量过高，直链淀粉分子之间相互作用的机会变少，也会造成抗性淀粉含量下降。

图1 水分含量对糯米RS3 含量的影响Fig.1 Effect of water content on the yield of resistant starch from waxy rice

2.1.2 超声时间对糯米RS3含量的影响 如图2 所示，当其他工艺条件不变时，超声时间在10～30 min时，抗性淀粉含量相对较高。随着超声时间的延长，抗性淀粉得率呈现先增加再减少的趋势。当超声时间为20 min 时，糯米RS3含量达到最大，为43.80%。超声过程中会发生气泡生长，膨胀、破碎的动态过程，气泡破裂瞬间会产生巨大的压力，在压力的作用下切断淀粉分子链[17]。在0～20 min 内，随着超声时间的延长，直链淀粉分子增多，增加了淀粉分子间相互作用的机会，促进了抗性淀粉的形成，使抗性淀粉含量从38.90%增长至43.80%。而超过20 min 抗性淀粉含量逐渐下降的原因可能是，超声过程中产生的线性短链阻碍了直链淀粉分子之间的相互作用，抑制双螺旋结构的形成[18]。

图2 超声时间对糯米RS3 含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of resistant starch from waxy rice

2.1.3 退火温度对糯米RS3含量的影响 如图3 所示，当其他工艺条件不变，在退火温度为50～70 ℃的范围内，抗性淀粉含量首先随温度升高而增加，并在55 ℃时有最大的抗性淀粉含量，为43.44%。而后，抗性淀粉含量不断下降，直至37.40%。超过55 ℃抗性淀粉含量开始下降，原因是温度过高，淀粉分子间的作用力被破坏，淀粉与水分子之间的作用力增强，使淀粉晶体发生凝胶化[19]。

图3 退火温度对糯米RS3 含量的影响Fig.3 Effect of annealing temperature on the yield of resistant starch from waxy rice

2.1.4 退火时间对糯米RS3含量的影响 如图4，当其他工艺条件不变时，退火时间在8～24 h 时，抗性淀粉含量从30.17%逐渐增加至43.61%，原因是退火处理能促进淀粉分子间的相互作用，易生成完美晶体结构，其抗性淀粉含量随之提升，Zhu 等[20]探究了退火处理对葛根淀粉消化率的影响，也得出了类似的结果。而当退火时间在24～40 h 时，抗性淀粉含量缓慢下降至40.62%，可能的原因是部分不完美晶体随着处理时间的延长而发生熔融，稳定晶体结构的分子作用力减弱，导致抗性淀粉含量减少[21]。

图4 退火时间对糯米RS3 含量的影响Fig.4 Effect of annealing time on the yield of resistant starch from waxy rice

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面优化结果分析 根据单因素实验结果，选择水分含量（A）、超声时间（B）、退火温度（C）、退火时间（D）为变量，抗性淀粉含量为响应值（Y）进行响应面优化分析，响应面试验结果如表2 所示。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

2.2.2 模型建立及显著性分析 利用 Design-Expert 8.0.6 对表2 中的数据进行多元回归拟合分析，得到回归方程为：Y=43.50-0.77A+0.37B+0.41C+0.48D+0.13AB-0.30AC-0.14AD-0.11BC-0.15BD+0.14CD-1.57A2-0.48B2-3.62C2-1.28D2。试验数据方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

如表3 所示，响应面多元回归拟合模型极显著（P＜0.01），失拟性检验不显著（P=0.9140＞0.05），R2为0.9284，表明模型选择合适。因此，能够运用该模型来描述各变量与抗性淀粉含量的关系。依据表3中的F值大小可以看出四个因素影响抗性淀粉含量的主次顺序为：水分含量（A）＞退火时间（D）＞退火温度（C）＞超声时间（B），据P值可知，水分含量A 与A2、C2、D2对抗性淀粉含量的影响是极显著的（P＜0.01）。超声时间B、退火温度C、退火时间D 的P值均大于0.05，表明这3 个因素对抗性淀粉含量无显著影响。

2.2.3 响应面优化及验证试验 利用Design-Expert 8.0.6 软件，作出各因素间的交互作用对抗性淀粉含量影响的曲面图及等高线图。根据上述回归拟合方程，固定任意2 个因素，得到另外2 个因素绘制的响应面曲线和等高线图。响应面图均为开口朝下的凸型曲面，有抗性淀粉含量极大值点。等高线图多呈现近圆形，且交互项P值均大于0.05，意味着两两因素之间交互作用影响不显著[22]。

根据模型拟合出的最佳的工艺条件为：水分含量67.54%，超声时间23.13 min，退火温度55.33 ℃、退火时间25.47 h。在该条件下的预测值为43.71%。实际操作时将条件调整为：水分含量68%，超声时间23 min，退火温度55 ℃，退火时间25 h。在此条件下进行验证试验的抗性淀粉含量为45.61%±0.95%，与理论的预测值相近，相对误差为4.34%。由此可见，利用响应面分析法优化抗性淀粉工艺条件是合适的。

2.3 理化性质分析

2.3.1 透明度分析 淀粉样品的透明度与淀粉中直链淀粉含量、膨胀能力以及膨胀和未膨胀残留颗粒水平有关[23]。如表4 所示，超声退火糯米RS3与糯米淀粉相比淀粉糊透明度从9.53%明显提升至47.72%，造成这种现象的原因是普鲁兰酶脱支破坏了原淀粉的淀粉表面及结晶区，从而导致淀粉与水结合作用的增强，淀粉分子间的作用力减弱[24]；超声波能增强样品的机械振动，有助于更多空气通过液体介质产生更多空化核，增强其对淀粉的作用效果，淀粉与水分子间缔合能力增强，从而减少了光的折射和反射，使淀粉糊透明度提高[25]。

表4 糯米淀粉与其制备的糯米RS3 理化性质比较Table 4 Comparison of physicochemical properties of waxy rice starch and resistant starch

2.3.2 溶解度和膨胀能力 以10 ℃为间隔测定糯米淀粉与超声退火糯米RS3在50～90 ℃的溶解度和膨胀能力如表4 所示。当温度从50 ℃升至90 ℃，糯米淀粉的溶解度从0.64%上升至6.03%，糯米RS3从23.42%增至52.45%；相应地，其膨胀能力也分别从2.24 和3.23 g/g 增加到41.04 和6.38 g/g。由此可知，所有淀粉样品的溶解度和膨胀能力随温度的升高随之上升。这是由于淀粉分子内的作用力随温度升高被削弱，因此加速了直链淀粉浸出并促进颗粒膨胀[14]。同时，因为淀粉受普鲁兰酶脱支前处理和超声波作用的影响导致大量线性葡聚糖的产生，而高比例的可溶性短链葡聚糖会直接导致溶出量增加。因此，在50～90 ℃下，糯米RS3溶解度均高于糯米淀粉的溶解度，其中在90 ℃下糯米淀粉和糯米RS3有最大的溶解度，分别为6.03%和52.45%。在50～60 ℃的较低温度下糯米淀粉膨胀能力低于超声退火糯米RS3，而在较高温度（70～90 ℃）下却呈现相反的结果，其中糯米淀粉在60～70 ℃下的变化尤为明显，从2.81 g/g 升至32.07 g/g，原因是淀粉的溶胀行为是由于支链淀粉的膨胀而引起的[26]，在未达到淀粉的糊化温度以前，淀粉分子与水的结合作用受温度影响较小，而当到达糊化温度以后因糯米淀粉含有大量的支链淀粉，其淀粉颗粒易溶胀、崩溃，因此膨胀能力高于糯米RS3。

2.3.3 扫描电镜分析 利用扫描电镜（SEM）研究了糯米淀粉与经超声退火制备的糯米RS3的颗粒表面形态，如图5。糯米淀粉颗粒形状呈现为不规则多边形，其表面较光滑，颗粒直径多在3～8 μm。与原淀粉相比，糯米抗性淀粉颗粒形状呈现出明显的差异，其表面粗糙多孔，颗粒直径大小不一。这可能是酶解和超声波空化作用产生大量直链淀粉，而退火处理能使直链淀粉聚集形成螺旋复合体，Babu 等[27]认为这种现象会增强晶体结构，从而提高其抗酶解能力。

图5 糯米淀粉与糯米RS3 的扫描电子显微镜图Fig.5 SEM of waxy rice starch and resistant starch

2.3.4 傅里叶红外光谱分析结果 为了探究超声退火法制备糯米RS3对其短程有序结构的影响，如图6 所示，显示了糯米淀粉、糯米RS3的FT-IR 光谱（图6a）及1200～800 cm-1的去卷积图谱（图6b）。如图6a 两种淀粉的吸收峰都很相似，证明超声退火法没有明显改变其化学基团。图6b 淀粉红外吸收光谱中1047 和1022 cm-1处的特征峰表示淀粉的结晶区与非结晶区。1047 与1022 cm-1的比值来描述淀粉的有序程度，抗性淀粉的含量越高其有序程度越高，故该比值越大[28]。糯米淀粉与超声退火糯米RS3的1047 与1022 cm-1的比值分别为1.284，1.671，显然，糯米RS3比糯米淀粉的1047/1022 的值要大，说明超声退火工艺能促进形成更多双螺旋结构，使超声退火糯米RS3拥有更多短程有序结构。

图6 糯米淀粉和糯米RS3 傅里叶红外光谱图（a）和去卷积图（b）Fig.6 FT-IR spectra (a) and deconvolution graph (b) of waxy rice starch and resistant starch

2.3.5 热稳定性分析 由表5 可知，相较于糯米原淀粉，糯米RS3的起始糊化温度（T0）、峰值温度（Tp）和终止温度（Tc）均有小幅提升。这是因为超声退火处理能促进淀粉的重结晶，生成抗性淀粉。而晶体结构周围的的无定型区可能受其影响，难与水形成氢键[29]，故导致糊化温度升高。同时，糯米淀粉和糯米RS3的糊化焓分别为11.91 和16.96 J/g，经超声退火处理的糯米RS3的焓值明显高于原淀粉，这是因为退火处理使双螺旋结构之间形成了更多氢键，增强了晶体结构[30]，说明要破坏其晶体结构就需要更多能量。由此可知，超声退火法制备的糯米RS3有较高结晶度的晶体结构和良好的热稳定性。

表5 淀粉样品的热特性参数Table 5 Thermal properties of native starch and resistant starch

2.3.6 X 射线衍射分析 通过X-射线衍射我们可以判断淀粉的晶型和计算其结晶度。如图7 所示，糯米淀粉在15°、17°、18°、23°的位置出峰，可以判断糯米淀粉为典型的A 型晶体，而糯米RS3在15°、17°、22°、24°的位置有特征峰，为典型的B 型晶体，并在20°的位置出现了一个弱衍射峰，表现为V 型晶体，说明有淀粉-脂质复合物的存在，通常认为，是直链淀粉的长链在回生过程中在固有脂质分子上卷曲而形成的复合体[31]。由此表明，经超声退火制备的糯米抗性淀粉改变了淀粉的原有晶型，且糯米RS3的结晶度为41.8%明显比糯米原淀粉的30.0%高，说明超声退火制备的糯米抗性淀粉具有较高的结晶度，这与DSC 的结果一致。不同的晶体形态会显示出不同的酶解性质，其中V 型晶体抗酶解能力最强，A 型最弱[32]。由此可知，糯米RS3由抗酶解能力较弱的A 型转变为了更耐酶解的B+V 型。

图7 糯米淀粉和糯米RS3 X 射线衍射图谱Fig.7 X-ray spectra of waxy rice starch and resistant starch

3 结论

本研究以普鲁兰酶脱支前处理的糯米淀粉为原料，采用超声退火法制备糯米RS3。经响应面试验设计优化得出的最佳工艺条件为：水分含量68%，超声时间23 min，退火温度55 ℃，退火时间25 h。在此条件下制备的抗性淀粉含量为45.61%±0.95%。糯米RS3的透明度和溶解度较原淀粉均有较大提升，但膨胀能力有所下降。扫描电镜显示，超声退火处理破坏了淀粉颗粒形状，使糯米RS3呈现粗糙多孔结构。通过红外光谱、DSC 和XRD 等分析证实，该工艺可促进生成抗性淀粉、优化结晶晶型、提高结晶度，使糯米RS3具有良好的热稳定性。本研究可为超声退火法制备糯米RS3的工业化生产提供相应的理论依据，而具有良好功能特性的RS3未来可作为功能性食品配料应用于食品工业中。但现阶段制备的RS3含量还未达到预期，有待日后研究并进一步提高。