基于RPA-LFD 法的多黏菌素耐药基因mcr-1 可视化快速检测方法建立与应用

焦 雪，董羽织，王靖雯，吕晨泽，方结红，蒋 晗

（中国计量大学生命科学学院浙江省特色农产品品质及危害物控制技术重点实验室，浙江杭州 310018）

多黏菌素是一种提取于多粘芽孢杆菌变种的多肽类抗生素，临床上用于治疗多重耐药革兰氏阴性菌引起的感染，被称为抵抗多重耐药细菌感染的“最后一道防线”[1-2]。此外，硫酸粘菌素也在全球养殖业中作为细菌性疾病治疗用药而广泛应用[3]。然而，自2015 年质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1首次被报道后[4]，其在临床、食品、畜牧养殖、水产及相关环境中屡屡检出[5-6]。Borowiak 等[7]分析了德国联邦风险评估研究所从动物、食物、饲料和环境中收集的耐药沙门氏菌，发现mcr-1基因在德国家畜和食品来源的沙门氏菌中广泛流行。此外，mcr-1基因也普遍存在于大肠埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌中[8-11]。有报道显示，动物源、动物性食品源和人源肠杆菌科细菌中，mcr-1基因检出率在5%～30%[12-13]。与其他国家相比，我国的mcr-1基因检出率较高，在5%～80%之间[14-16]。mcr-1基因的流行率高且传播速度快，严重威胁了公众安全和人类健康，因此亟需建立一种适用于基层的的检测方法对该耐药基因进行快速诊断和及时监测。

目前，对mcr-1基因的检测，主要是基于传统PCR、荧光定量PCR 以及数字PCR 等技术的分子检测方法[17-20]。这些检测方法重复性、特异性均较好，但大多数仍存在反应时间长、操作较为繁琐等弊端，且相关实验设备昂贵，对技术人员的熟练度要求高，不适用于基层对目的样品的快速检测。重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）被称为是可以替代PCR 的核酸检测技术，其特点是能够在常温条件下实现核酸扩增[21]。RPA 技术使用重组酶促进寡核苷酸引物与其双链DNA 分子互补序列结合，该过程由单链DNA 结合蛋白辅助，可防止引物解离，之后由DNA 聚合酶进行复制[22]。RPA 技术具有反应时间快速、操作简便、灵敏度高等优点，一般在20～30 min 即可获得检出范围内的扩增产物，非常适用于基层检测[23-26]。通过与荧光基团标记后，获得的扩增产物可与侧流层析试纸条（lateral flow dipstick，LFD）相结合，能够实现可视化检测。RPA 技术在临床检验、动物疫病诊断、畜牧养殖产业、微生物及其耐药性检测等领域均有涉及，已成功应用到日本血吸虫、非洲猪瘟病毒、猪嵴病毒、布鲁氏菌病等的检测中，结合LFD 后，其定性检测结果可在2～5 min 内直接进行判定[27-30]。此外，LFD 检测结果可通过手持式胶体金读数仪扫描，读取T/C 值，进一步实现目的基因的定量检测。

本研究利用RPA-LFD 技术辅以手持式胶体金读数仪，建立了一种快速、高效、可应用于基层的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的检测方法，这对多黏菌素耐药基因mcr-1的快速检测、切断传播途径、保障人们身体健康具有十分重要的意义[31-33]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

携带mcr-1基因的重组质粒pGM-T-mcr-1、携带质粒pGM-T-mcr-1的重组大肠杆菌Escherichia coliTop10-pGM-T-mcr-1本实验室前期构建；质粒pGM-T、大肠杆菌E. coliTop10 杭州纽贝生物科技有限公司；质控菌株大肠杆菌E. coliATCC 25922（不含耐药基因） 美国典型培养物保藏中心；不携带mcr-1基因的大肠杆菌E. coli、弯曲肠杆菌Enterobacter campylobacter、霍氏肠杆菌E. hormaechei、干酪乳杆菌Lactobacillus casei实验室前期分离鉴定；15 株大肠杆菌分离株E. coli（菌株编号E1～E15）、15 株弯曲肠杆菌分离株E. campylobacter（菌株编号EC1～EC15） 来源于浙江省某养殖场的猪粪样品，为实验室前期分离保存；15 份生猪养殖场环境样品（样品编号SZ1～SZ15） 来源于浙江省某养殖场猪粪（取生猪新鲜粪便分别密封于无菌均质袋中，置于装有冰袋的泡沫箱中，密封后在2 h 内运送回实验室处理）；15 份肉鸡养殖场环境样品（样品编号RJ1～RJ15） 来源于浙江省某养殖场鸡粪（处理方法同上）；15 份猪肉样品（样品编号ZR1～ZR15）和15 份鸡肉样品（样品编号JR1～JR15） 浙江省某农贸市场（处理方法同上）；营养琼脂培养基、LB 液体培养基和甘油等生化试剂 青岛海博生物技术有限公司；RPA 核酸扩增试剂盒（基础型） 英国TwistDX 公司；其它常规生化试剂 美国Sigma 公司；PCR 试剂、细菌质粒提取试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒等分子生物学试验用试剂 宝生物工程（大连）有限公司。

SW-CJ-2FD/2F 超净工作台 上海BOXUN 公司；GT14DP 高压蒸汽灭菌锅 美国ZEALWAYF公司；NanoDrop 2000c 超微量紫外分光光度计 美国Thermo Scientific 公司；EPS-600 电泳装置 上海Tanon 公司；Arktik PCR 仪 美国Thermo Scientific 公司；Gel Doc EZ 凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad 公司；TSR-200 手持式胶体金读数仪 杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 携带mcr-1基因的标准质粒pGM-T-mcr-1制备 在-80 ℃冰箱中取出实验室冻存的携带mcr-1基因的重组大肠杆菌E. coliTop10-pGM-T-mcr-1划线于LB 琼脂培养基，于37 ℃过夜培养，挑取单菌落于LB 液体培养基中，摇床中37 ℃，200 r/min培养至菌液OD600为1.0，参照细菌质粒提取试剂盒操作说明书方法提取携带mcr-1基因标准质粒pGM-T-mcr-1。利用Nanodrop 2000c 紫外分光光度计测定标准质粒浓度。采用煮沸法制备待测大肠杆菌E. coli、弯曲肠杆菌E. campylobacter、霍氏肠杆菌E. hormaechei、干酪乳杆菌L. casei等菌液模板DNA：取1 μL 待测菌液加入30 μL Tris 缓冲液，煮沸5 min，冰上冷却2 min，离心12000 r/min，2 min，取上清液用作DNA 模板[34]。

1.2.2 PCR 和RPA 引物设计 登录NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载mcr-1基因序列，分析目标基因mcr-1序列的多态性并确定其保守区域。针对保守区域序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计PCR 与RPA 引物。PCR 与RPA 引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RPA 扩增和PCR 扩增引物序列Table 1 Sequence of RPA amplification and PCR amplification primers

1.2.3 PCR 与RPA 反应体系与反应程序 PCR 反应体系：总体系25.0 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 样本2 μL，灭菌去离子水8.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30次循环；72℃延伸20 s，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。取6 μL 扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，分析凝胶成像结果。RPA 反应体系（50.0 μL）：反应干粉1 管，Rehydration Buffer 29.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Mg2+2.5 μL，DNA 样本5.0 μL，灭菌去离子水11.0 μL。37 ℃孵育30 min。RPA 扩增产物纯化后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，分析凝胶成像结果。

1.2.4 RPA-LFD 可视化检测策略 RPA-LFD 可视化检测策略如图1 所示。RPA 引物荧光集团标记：mcr-1-rpa-F2 引物5’端标记Biotin，mcr-1-rpa-R2 引物5’端标记Digoxin；LFD 试纸条制备：利用金标点膜仪将0.65 mg/mL 抗Biotin 单克隆抗体、1 mg/mL羊抗鼠多克隆二抗和10 μg/mL 的胶体金标记Digoxin单抗溶液分布均匀标记在LFD 试纸条NC 膜的检测线T 线、质控线C 线和结合垫上。将标记好的NC 膜和结合垫置于烘箱37 ℃干燥12 h。将干燥好的NC 膜、结合垫与样品垫、吸收垫和底板组合组装成LFD 试纸条；RPA-LFD 可视化：将稀释后的RPA 扩增产物滴加到LFD 试纸条样品垫，标记有Biotin 和Digoxin的扩增产物侧向层析后被包被在检测线T 的抗Biotin 单克隆抗体捕获，被捕获的扩增产物因标记有Digoxin，将胶体金标记Digoxin 单抗捕获在T 线，多余的胶体金标记Digoxin单抗在控制线C 线被包被的多克隆二抗捕获，最终实现T 线、C 线显色；当扩增产物无目标产物时，则只有C 线显色；可用TSR-200 手持式胶体金读数仪读取试纸条T/C 值，记录数据，分析检测定量结果。

图1 RPA-LFD 可视化检测原理图Fig.1 Schematic diagram of RPA-LFD visual inspection

1.2.5 RPA-LFD 方法的优化 RPA 反应体系见1.2.3。用LFD 试纸条缓冲液将RPA 扩增产物稀释50 倍进行LFD 侧流层析。5～10 min 内读取结果。为提高目标基因的扩增效率，获得最优的反应条件，对RPA-LFD 可视化体系的反应温度、反应时间以及Mg2+反应浓度进行了优化。设置反应温度梯度为：30、35、37、39、45 和50 ℃；固定反应温度以及Mg2+反应浓度，设置反应时间梯度为：2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5 和30 min；设置Mg2+反应浓度梯度为：2.8、5.6、8.4、11.2、14 和16.8 mmol/L。在研究一个变量时，RPA 反应的其它条件按照

1.2.3 里的条件固定。

1.2.6 RPA-LFD 方法特异性分析 采用优化后的RPA-LFD 体系，以重组质粒pGM-T-mcr-1和重组大肠杆菌E. coliTop10-pGM-T-mcr-1为阳性对照，以质粒pGM-T、大肠杆菌E. coliTop10、耐药敏感菌株大肠杆菌E. coliATCC25922、以经鉴定不携带mcr-1基因的大肠杆菌E. coli、弯曲肠杆菌E.campylobacter、霍氏肠杆菌E. hormaechei、干酪乳杆菌L. casei分离株为阴性对照，以灭菌去离子水为空白对照，分析RPA-LFD 方法特异性。

1.2.7 RPA-LFD 方法灵敏度分析 利用Nanodrop 2000c 紫外分光光度计测定提取的pGM-T-mcr-1标准质粒浓度，并计算标准质粒拷贝数。拷贝数计算公式为：拷贝数/μL=质粒浓度（ng/μL）×6.02×1023/（660×质粒长度），其中6.02×1023为1 摩尔中含有的摩尔分子（拷贝数）；660 为计算dsDNA 平均分子量的常数。用Tris-HCl 缓冲液以10 为倍数梯度稀释标准质粒，制备108、107、106、105、104、103、102、101、100和10-1copies/μL 浓度梯度的标准质粒溶液。以10 倍浓度梯度稀释的标准质粒溶液为模板，采用优化的最优RPA-LFD 反应，分析RPA-LFD 方法灵敏度。同时，利用读数仪读取LFD 试纸条T/C 值，以T/C 值为纵坐标轴，以标准质粒拷贝数浓度的lg10对数为横坐标轴，建立mcr-1基因定量标准曲线。

1.2.8 RPA-LFD 方法用于模拟食样检测 从当地农贸市场购买猪肉和鸡肉等样品，参考GB 4789.1 进行样品前处理，制成样品液。用细菌基因组DNA 提取试剂盒法提取样品DNA，采用常规PCR 方法确证所有样品中不含mcr-1耐药基因。将标准质粒添加到猪肉和鸡肉样品，使得样品中标准质粒菌株的终浓度为104～100copies/μL，制备样品液并提取样品DNA，用建立的RPA-LFD 方法分析模拟食样中携带mcr-1基因情况。

1.2.9 RPA-LFD 方法用于实际样品检测 利用RPA-LFD 方法和常规PCR 方法，分析15 份猪肉样品（样品编号ZR1～ZR15）、15 份鸡肉样品（样品编号JR1～JR15）、15 份生猪养殖场环境样品（样品编号SZ1～SZ15）、15 份肉鸡养殖场环境样品（样品编号RJ1～RJ15）、15 株大肠杆菌分离株E. coli（菌株编号E1～E15）和15 株弯曲肠杆菌分离株样品E. campylobacter（菌株编号EC1～EC15）中携带mcr-1基因情况，分析RPA-LFD 方法与常规PCR 方法检测结果一致性。

1.3 数据处理

利用Adobe Photoshop CC 2019将所得电泳、试纸条图片进行标注；利用OriginLab Origin 2021 对数据进行处理并制作柱状图。

2 结果与分析

2.1 RPA-LFD 检测方法反应条件优化

以mcr-1基因标准质粒pGM-T-mcr-1为模板，对RPA-LFD 方法的反应温度、反应时间以及Mg2+浓度进行优化。设置30～50 ℃温度梯度，对反应温度进行优化，结果显示，在35、37 和39 ℃的反应温度下，mcr-1基因检出效果均较好，电泳条带明亮且试纸条的目标检测线较为清晰（图2a1～图2a3）。设置2.5～30 min 反应时间梯度，对反应时间进行优化，结果显示，在电泳条带和试纸条颜色在反应20、22.5 和30 min 处清晰明亮，mcr-1基因检出效果均较好（图2b1～图2b3）。设置2.8～16.8 mmol/L 的Mg2+反应浓度梯度，优化Mg2+浓度，结果显示，Mg2+浓度达到14.0 和16.8 mmol/L 时mcr-1耐药基因检出效果均较好（图2c1～图2c3）。综上所述，结合高效与节约角度，37 ℃为最优反应温度，14 mmol/L 为最优Mg2+浓度，22.5 min 为最佳反应时间。

图2 RPA-LFD 反应条件优化Fig.2 Optimization of RPA-LFD reaction conditions

2.2 特异性试验

特异性试验按照1.2.6 进行，检测结果如图3 所示。经RPA-LFD 检测，仅重组质粒pGM-T-mcr-1和重组大肠杆菌E. coliTop10-pGM-T-mcr-1为的检测结果显示为阳性。质粒pGM-T、大肠杆菌E. coliTop10、耐药敏感菌株大肠杆菌E. coliATCC25 922、不携带mcr-1基因的大肠杆菌E. coli、弯曲肠杆菌E. campylobacter、霍氏肠杆菌E. hormaechei、干酪乳杆菌L. casei分离株等不含mcr-1耐药基因样品检测结果均显示为阴性。试验结果表明，本研究建立的RPA-LFD 检测mcr-1耐药基因的方法特异性好，与其他不携带mcr-1基因的质粒和分离株无交叉反应。

图3 RPA-LFD 特异性检测Fig.3 RPA-LFD specificity test

2.3 灵敏度试验

灵敏度试验按照1.2.7 进行，检测结果如图4 所示。以108～10-1copies/μL 浓度梯度的mcr-1基因标准质粒为RPA 扩增模板，进行RPA-LFD 灵敏度试验。结果表明 RPA-LFD 方法检测mcr-1耐药基因的检测灵敏度为 101copies/μL，具有较好的检测灵敏度。根据LFD 试纸条T/C 值和对应mcr-1基因标准质粒拷贝数浓度的对数，建立mcr-1基因RPALFD 定量标准曲线，结果显示，T/C 值和对应mcr-1基因标准质粒拷贝数浓度的对数存在显著的正相关性，标准曲线方程为y=0.117x+0.051，R2=0.9920。

图4 RPA-LFD 检测灵敏度Fig.4 RPA-LFD detection sensitivity

2.4 模拟食样检测

模拟食样检测按照1.2.8 进行，检测结果如表2所示。RPA-LFD 方法对添加mcr-1基因标准质粒的模拟食样的检出结果传统PCR 方法检测结果一致，且RPA-LFD 方法检测模拟样品中的携带mcr-1耐药基因的菌液的检出限可达101copies/μL，比PCR 方法的检出限102copies/μL 低1 个数量级。

表2 模拟食样检测结果Table 2 Test results of simulated food samples

2.5 实际样品检测

实际样品检测按照1.2.9 进行，检测结果如表3所示。在实际样品的检测试验中，RPA-LFD 方法与常规PCR 方法对15 份猪肉样品（样品编号ZR1～ZR15）、15 份鸡肉样品（样品编号JR1～JR15）、15 份生猪养殖场环境样品（样品编号SZ1～SZ15）、15 份肉鸡养殖场环境样品（样品编号RJ1～RJ15）、15 株大肠杆菌分离株E. coli（菌株编号E1～E15）和15 株弯曲肠杆菌分离株样品E. campylobacter（菌株编号EC1～EC15）中mcr-1基因携带情况进行分析，结果显示，RPA-LFD 方法与常规PCR 方法阳性样本检出率一致，共检出9 份mcr-1基因阳性样品。RPALFD 定量分析显示，阳性样品中mcr-1基因浓度在4.5×102～8.6×104copies/μL 之间。

3 讨论与结论

自细菌多黏菌素耐药基因mcr-1被报道以来，基于PCR 方法[17-20]和重组酶介导扩增方法[35]等检测方法相继出现。如屈素洁等[17]建立了blaNDM-1和mcr-1基因双重TaqMan 荧光定量PCR 检测方法，该法对mcr-1基因检出下限为1.63×101copies/μL，并且能够特异性的检出blaNDM-1和mcr-1基因质粒标准品，重复性好。沈伟伟等[18]建立了双重荧光定量PCR 检测携带mcr-1基因的鼠伤寒沙门菌的检测方法，该法对mcr-1基因检测的线性范围为1.40×101～1.40×108copies/μL，能够实现对携带mcr-1基因的鼠伤寒沙门菌的筛查与耐药性持续监测。车勇良等[35]建立了多黏菌素耐药基因mcr-1重组酶介导扩增结合荧光定量PCR 的方法，可在21 min 后出结果，能特异性地检测多黏菌素耐药基因mcr-1，最低检出限为102copies/μL 的mcr-1阳性质粒拷贝数。这些检测方法重复性、特异性均好，但大多数仍存在依赖大型仪器等不足，目前仍未见适用于基层进行耐药筛查和监测的mcr-1耐药基因快速检测方法。

本研究利用RPA-LFD 技术，是一项将重组酶聚合酶扩增、胶体金标记（三明治夹心法）、分子杂交和侧向流层析等方法相结合，且结果可视化的核酸检测技术[36]，与PCR 方法相比，不需要复杂的热循环和PCR 反应仪器，用时短，在此次细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的检测中，只需要37 ℃恒温扩增20 min即可完成，且检出限为101copies/μL，比PCR 法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR 法一致。若无恒温条件也可以手握进行核酸扩增，随后将扩增产物滴加在试纸条上便可用肉眼读数，也可用手持式胶体金读进行定量分析，十分简便快速。

综上，本研究建立的RPA-LFD 方法检测特异性、灵敏度好，缩短了检测时长，降低了对仪器设备及实验人员的依赖性。这对在生猪养殖场和肉鸡养殖场开展mcr-1耐药基因监测、切断传播途径、保障人们身体健康具有重要意义[37]；同时，可为其它致病微生物及其耐药基因的快速检测方法研究提供借鉴，使致病微生物及其耐药性基因的检测向高通量、高灵敏度、简便快捷、经济适用的方向发展。