糖脂代谢体外模型研究进展

庄肯,郭娜,廖文君,袁华,孙铜,吴春勇*

(1.中国药科大学药物分析系,江苏 南京 211198;2.济南市食品药品检验检测中心,山东 济南 250102;3.昆药集团股份有限公司,云南 昆明 650106;4.山东省食品药品检验研究院,山东 济南 250101)

糖代谢主要包括糖的无氧氧化、有氧氧化、磷酸戊糖途径、糖异生及糖原的合成与分解,是机体主要的供能途径,也为脂质、蛋白质及核苷酸等生物大分子的合成提供原料。脂代谢是指人体摄入的脂肪经脂肪酶水解为游离脂肪酸和甘油而进入血液循环的过程,可为维生素、激素和细胞膜的合成提供原料,并参与机体内多种信号调节。糖代谢和脂代谢的关系复杂,糖代谢的氧化过程和磷酸戊糖途径为脂质的合成提供能量及原料,而糖异生途径则可利用脂代谢产物合成糖类,二者的动态平衡对于维持机体稳态至关重要(见图1)[1]。

图1 糖脂代谢总览

随着经济发展,糖尿病、超重和肥胖等糖脂代谢紊乱性疾病严重威胁公共卫生安全[2]。由于发病机制复杂,相关药物研发亟需合适的糖脂代谢模型。此外,肿瘤细胞在适宜环境下表现出的无限增殖特性,主要是通过糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)过程的相互转换实现的[3],因此糖脂代谢模型研究对于肿瘤治疗也有重要意义。动物模型可从整体层面研究生理状态和不同疾病状态下糖脂代谢的变化及相关药物的治疗作用[4],但模型构建难度大,存在种属差异[5-6]。为此,各种体外研究模型应运而生。本文将对糖脂代谢体外研究常用的细胞及研究模型进行综述,为后续糖脂代谢体外研究模型的开发和改进提供参考。

1 糖脂代谢体外研究常用细胞

1.1 肝细胞作为糖类和脂质等内源性物质合成、代谢、储存和再分配的主要器官,以及药物等外源性物质代谢的主要器官,肝脏是目前糖脂代谢机制研究及相关药物筛选的主要研究器官。糖脂代谢体外研究常用的人肝细胞系主要有人原代肝细胞(primary human hepatocytes,PHH)、HepaRG细胞和HepG2细胞。PHH是肝脏体外代谢研究的金标准,在3D培养条件下,其体外代谢能力与体内条件相当,但获取难度高、不易实现体外长期培养[7]。HepaRG细胞是衍生自PHH的终末分化细胞,具有与PHH相近的糖脂代谢和药物代谢表达谱,但其获取成本较高,体外3D长期培养条件较为复杂,通常需要额外添加L-谷氨酰胺和地塞米松等添加剂[8-9]。Samanez等[10]发现HepaRG细胞的糖酵解过程由葡萄糖浓度和胰岛素水平共同调节,而脂肪生成途径仅由胰岛素调节,脂蛋白分泌主要受葡萄糖浓度影响。HepG2细胞获取难度低,体外3D长期培养条件简单,是体外糖脂代谢及药物代谢研究使用最多的细胞系,但其体外代谢能力与PHH和HepaRG相比严重不足[11-12]。Boon等[13]发现细胞外的营养成分水平是细胞成熟度的主要决定因素,培养体系中加入超生理量的氨基酸可以提高HepG2细胞的葡萄糖敏感性,促进其线粒体功能形成,增强其糖脂代谢和药物代谢能力。

1.2 肿瘤细胞肿瘤细胞在适宜环境下的无限增殖需要高效的能量生成,这主要是通过糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)过程的增强及相互转换实现的,因此糖脂代谢研究对于癌症治疗有重要意义。Dai等[14]发现在人结直肠癌细胞系(HCT116和SW480等)和人结直肠癌临床样本中葡萄糖转运体3(GLUT3)具有高表达水平,在生理条件(5 mmol·L-1葡萄糖)下GLUT3可通过增加葡萄糖摄取和促进核苷酸合成加速结直肠癌细胞生长,并增加结直肠癌细胞对维生素C的敏感性,可为临床治疗提供参考。Shen等[15]发现血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)在人肺癌细胞系(H358和H827等)和人肺癌临床样本中高度表达,该酶可通过抑制糖酵解途径减少肺癌细胞的葡萄糖摄取,进而抑制其增殖。

2 糖脂代谢体外2D模型

2D模型通常将细胞以单层形式进行平面培养,操作简便、重复性好,但体内相似性不足。Nagarajan等[16]发现在2D条件下,HepG2细胞的葡萄糖摄取量是人体生理条件下的14倍,但糖原含量和葡萄糖氧化率仅有50%左右,葡萄糖产生量仅为30%左右,且上述结果均不受胰岛素刺激影响,表明2D条件下HepG2细胞的糖代谢行为与人体生理条件相差较大。同时,Wei等[17]发现在2D条件下,HepG2细胞的24 h葡萄糖消耗量为5 μmol/106个细胞,PHH为20 μmol/106个细胞,而人体生理条件下可达133.2 μmol/106个细胞。Vinci等[18]发现在2D条件下,HepG2细胞的甘油含量为0.28 mmol·L-1/106个细胞,仅为人体生理条件的1.4%(20 mmol·L-1/106个细胞)。

3 糖脂代谢体外3D模型

3D模型是将细胞在具有不同3D结构的载体上或通过其他方式使其在3D立体空间中生长、迁移和分化的模型。相较于2D模型而言,3D模型中整个细胞表面都存在与其他细胞或基质的相互作用,细胞生长形态更加接近体内,可更加真实地反映体内情况[19]。目前应用于糖脂代谢体外研究的3D模型主要有细胞球样体和器官芯片。

3.1 细胞球样体细胞球样体主要是细胞经悬滴培养、低黏附培养板培养、旋转培养或利用细胞支架培养而自组装形成的细胞聚集体,可更真实地模拟体内条件下的细胞-细胞、细胞-细胞外基质相互作用(见图2a[20])。Balkrishna等[21]通过悬滴培养法构建了HepG2细胞球样体非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型,该模型甘油含量可达16 mmol·L-1/106个细胞,与人体生理条件接近,且在糖尿病治疗药物吡格列酮的作用下,其甘油含量可降低至8 mmol·L-1/106个细胞,经处方药利沃沙(Livogrit)治疗后,该模型的谷草转氨酶(AST)和谷胱甘肽(GSH)明显下调至正常生理水平,发现了利沃沙有作为肝保护剂的潜力。Rousset等[22]通过悬滴培养法构建了人结直肠癌细胞(HCT116)球样体,并结合电化学技术成功构建了葡萄糖氧化酶生物传感器(见图3),通过葡萄糖氧化酶(GOx)功能化水凝胶氧化葡萄糖,产生H2O2,测定H2O2浓度以反映葡萄糖浓度,实现了对细胞球样体的葡萄糖动力学研究,发现形成球样体后葡萄糖消耗更加迅速、消耗量更多,并建立了体外-体内外推(IVIVE)函数关系式,具有高度体内相关性。Pingitore等[23]通过低黏附培养板构建了由HepG2细胞和肝星状细胞LX-2构成的共培养细胞球样体NASH模型,将其暴露于游离脂肪酸环境中染色后可通过显微镜观察到脂肪和胶原蛋白的积累,其分布情况与体内相似,且经NASH治疗药物利拉鲁肽治疗后,脂肪变性程度减少了50%。Tidwell等[24]利用低黏附培养板构建了人结直肠癌细胞(HCT116和SW948)球样体,发现与2D条件相比,3D细胞球样体的糖酵解作用更强,ATP生成量更多。Kurano等[25]利用旋转培养法构建了HepG2细胞球样体,2D条件下HepG2细胞分泌的载脂蛋白(Apo)含量为5 ng·mg-1,而该模型的Apo分泌量可达27 ng·mg-1,更加接近人体生理条件下的40 ng·mg-1。Smith等[26]利用旋转培养法构建了人结直肠癌上皮细胞(DLD1)球样体,发现处于“静止”状态(即暂停增殖状态)的DLD1细胞代谢活性比增殖状态更高,其葡萄糖和谷胱甘肽消耗量增加了2倍,乳酸分泌量增加了1.8倍,解释了体内条件下观察到的“静止”状态的肿瘤细胞的高代谢活性和肿瘤组织内部环境呈酸性的原因。Wei等[17]通过将半乳糖枝接在聚苯乙烯纤维上形成了一种全新的细胞支架,并以此构建了HepG2细胞球样体,与2D条件相比,细胞球样体的24 h葡萄糖消耗量和糖原含量均提高了近2倍,糖异生率、总胆固醇含量和甘油三酯含量提高了近3倍,更加接近人体生理水平,且对于激素和降糖降脂药物更加敏感,可用于药物筛选。

a.细胞球样体;b.器官芯片

a.电化学装置示意图;b、c.检测原理图(GOx:葡萄糖氧化酶)

3.2 器官芯片器官芯片又称“生物反应器”,是将细胞接种在主要以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料的反应室中,借助微流控技术,通过机械作用将培养基以极低的流速持续灌注至反应室中以实现液体循环流动的装置,可以模拟细胞在体内条件下受到的因液体流动而引起的机械作用(见图2b[27])。Vinci等[28]构建了一个多室器官芯片,发现HepG2细胞与脂肪细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养后,24 h葡萄糖消耗量提高了近8倍,达到79.6 μmol/106个细胞,接近人体生理水平。Tao等[29]利用人诱导性多能干细胞(hiPSCs)构建了人肝脏-胰岛类器官芯片,共培养体系使肝细胞糖脂代谢相关酶和CYP450酶的基因表达量显著提高,24 h葡萄糖消耗量提高了1.1倍,达到85 μmol/106个细胞,与人体生理水平相近,同时在高糖条件(25 mmol·L-1葡萄糖)下,肝细胞表现出线粒体功能障碍和葡萄糖转运能力降低,通过二甲双胍治疗得到显著改善。Kemas等[30]利用器官芯片进行了PHH的3D长期培养,发现每个PHH细胞球样体的细胞数在3 000个以下时,球样体的葡萄糖消耗量与细胞数呈正比例关系,同时利用该球样体构建了胰岛素抵抗(IR)模型,证明了肝脏特异性IR会导致脂肪生成和糖异生率增加,并揭示了IR是导致NASH的关键因素。Cipriano等[31]利用中空纤维式器官芯片对HepG2细胞进行了3D培养,与2D条件相比,3D条件下HepG2细胞的24 h葡萄糖消耗量提高了近5倍,达到66.7 μmol/106个细胞,同时CYP450酶和糖脂代谢相关酶的基因表达量也均有显著提高,对于具有细胞毒性的双氯芬酸也更加敏感,适合用于药物筛选。

4 总结与展望

随着糖尿病、超重和肥胖等糖脂代谢紊乱性疾病患病率逐年提高,糖脂代谢机制研究及相关药物筛选的重要性不言而喻,对于具有高度体内相似性的糖脂代谢体外模型的需求愈发迫切。体外3D模型可以模拟细胞-细胞、细胞-细胞外基质的相互作用,相较于2D模型更加接近体内环境,同时通过多种细胞共培养,可进一步提高3D模型的体内相似性。但目前已构建的体外3D模型的糖脂代谢能力与体内条件相比仍有差距,模型构建技术、细胞培养条件和共培养体系还需进一步优化,相信在未来会出现更多种类的体外模型,在糖脂代谢机制研究及相关药物筛选中发挥更重要的作用。