芍药苷及芍药苷磷脂复合物胶束在体肠吸收对比分析

袁腾腾,常红,唐亚楠,吕淑婕,方亮,王雷,陈卫东*,张彩云*

(1.安徽中医药大学药学院,药物制剂技术与应用安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;2.安徽省教育厅现代药物制剂工程技术研究中心,安徽 合肥 230012;3.中药复方安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012; 4.安徽省道地中药材品质提升创新协同中心,安徽 合肥 230012)

芍药苷(PF)是中药芍药的主要有效成分,具有广泛的药理活性,如抗抑郁、扩张血管、止痛、抗癌、抗炎、降血糖、预防各种肾脏疾病等[1-7]。但PF作为一种高水溶性的酚类化合物,脂溶性差,不易通过细胞膜,生物利用度较低,从而限制了其疗效的发挥和临床广泛应用[8-10]。将药物制成磷脂复合物(PLC)可提高药物的亲脂性,促进药物透过生物膜,改善药物在胃肠道内的吸收[11]。基于课题组前期制备的芍药苷磷脂复合物(PF-PLC)及PF-PLC胶束以提高PF的脂溶性和生物利用度的工作基础[12-13],本研究深入考察了PF-PLC胶束在大鼠体内的肠吸收情况,并与PF进行了比较研究,以期为临床开发PF-PLC新剂型提供科学实验依据。

1 仪器与材料

1.1 试药芍药苷(批号:CFN99544,纯度:>98%,阿拉丁试剂有限公司);芍药苷磷脂复合物胶束(实验室自制);维拉帕米(纯度>98%,批号:C13026964);乌拉坦(批号:030412,上海化学试剂厂);甲醇和乙腈均为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器Ultimate 3000超高效液相色谱仪(Thermofisher公司);循环泵(保定雷弗流体科技有限公司);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.3 实验动物健康SD大鼠,雄性,体重(270±20)g,从安徽医科大学实验动物中心处采购。实验动物生产许可证号:SCXK(皖)2017-001,实验动物使用许可证号:SYXK(皖)2020-001,伦理号为AHUCM-rats-2021089。从购买之日起,大鼠适应性饲养7 d,环境温度22～24 ℃,相对湿度50%～65%,12 h/12 h光照/黑暗循环。每天称量体重,正常饮水饮食,实验前禁食12 h。

2 方法

2.1 试液的配制Krebs-Ringer(K-R)试液:称取氯化钠3.9 g,氯化钙0.185 g,氯化钾0.175 g,氯化镁0.01 g,磷酸二氢钠0.16 g,葡萄糖1.4 g于1 000 mL烧杯中,加入蒸馏水300 mL,将烧杯放入超声波清洗器中超声处理使其溶解完全,再加入0.68 g的碳酸氢钠粉末,超声使其溶解完全,再加蒸馏水至500 mL,混匀,即得K-R试液,4 ℃冷藏保存备用。

空白K-R肠灌流液:取K-R液适量,按在体单向肠灌流模型操作方法灌流,收集得空白K-R肠灌流液。

PF储备液:精密称取PF 4.01 mg,置于10 mL的棕色容量瓶中,超纯水溶解并定容至刻度,得到浓度为 401 μg·mL-1的PF标准储备液,放置于4 ℃冰箱。

不同浓度PF灌流液:精密称取PF原料药,用K-R试液配制成含PF为5、10、20 μg·mL-1的溶液。

不同浓度PF-PLC胶束灌流液:取PF-PLC胶束,用K-R试液配制成的含PF为5、10、20 μg·mL-1的溶液。

2.2 样品处理方法将收集的待测灌流液样品吸取一部分于EP管中,5 000 r·min-1,离心5 min后经0.45 μm微孔滤膜过滤后,按上述色谱条件进样测定,记录色谱图。

2.3 肠灌流样品分析方法的建立

2.3.1 色谱条件色谱柱:Cosmosil 2.5C18-MS-Ⅱ(3.0 ID×100 mm);流动相:乙腈∶0.1%磷酸(14∶86,V/V);柱温:30 ℃;流速:0.2 mL·min-1;检测波长:230 nm;进样量:2 μL。

2.3.2 专属性考察在“2.3.1”项下色谱条件,将空白灌肠液,空白灌肠液+PF对照品,含药灌肠液分别进样测定,考察其方法专属性。

2.3.3 标准曲线精密吸取PF对照品储备液适量置于容量瓶中,用K-R试液将其稀释,配制成2.5、5、10、20、40、60、100 μg·mL-1PF对照品溶液。按“2.3.1”项下色谱条件,进样测定,以待测物的峰面积为纵坐标,待测物的浓度为横坐标进行线性回归,得标准曲线方程。

2.3.4 精密度试验精密移取上述PF储备液,用空白肠灌流液稀释成2.5、7.5、15.8、75 μg·mL-1的定量下限、低、中、高4个浓度的PF溶液各5份,按照“2.3.1”项下色谱条件进行测定,计算日内精密度和日间精密度。

2.3.5 回收率试验取7.5、15.8、75 μg·mL-1的低、中、高3个浓度的PF标准品各5份,按照“2.3.1”项下色谱条件进行测定。

2.3.6 稳定性试验用空白肠灌流液分别配制低、中、高(7.5、15.8、75 μg·mL-1)3个浓度样品,每个浓度平行配制5份,置于密闭容器中,在37 ℃的水浴中放置,分别于放置3、5、12 h取样,按照“2.3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积,计算RSD值。

2.4 大鼠单向肠灌流实验实验前用灌流液平衡灌流系统,至进口与出口药物浓度相等。大鼠实验前禁食不禁水18 h后,用乌拉坦麻醉后,将四肢固定在手术板上并维持体温。剪开腹部,分离出小肠,量取十二指肠,两端切口插管后结扎,结扎总胆管,自幽门处下行2 cm处向下量取约10 cm为十二指肠部位。用37 ℃生理盐水以1 mL·min-1清洗肠段排出内容物至流出液清澈,用空气排空肠腔内残余的生理盐水,随后更换含药灌流液。以0.2 mL·min-1流速灌流并计时,平衡30 min后开始收集流出液,每隔15 min合并1次流出液,收集至150 min结束。处死大鼠,量取每只大鼠十二指肠的长度和半径,计算灌流肠段表面积。实验中每只大鼠只使用单一肠段进行单次试验,以保证大鼠肠道良好的吸收状态。

本实验采用质量法计算药物吸收速率常数(Ka)和有效渗透系数(Peff)。

式中:Cin表示灌流液中入口药物浓度( μg·mL-1),Cout为出口处实际测得的浓度( μg·mL-1),l为灌流肠段的长度(cm),Q为肠道灌流液的流速(mL·min-1),r表示灌流肠段的内径(cm)。

3 结果

3.1 专属性考察专属性考察的结果见图1,结果表明,PF及PF-PLC胶束保留时间分别为14.632、14.643 min,空白肠灌流液对PF及PF-PLC胶束的测定没有干扰,方法专属性良好。

3.2 标准曲线以峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标绘制标准曲线并对其进行线性拟合得出线性方程为Y=0.152 1X-0.160 8(R2=0.999 3),结果如表1和图2所示,表明PF在2.5～100 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。

3.3 精密度试验精密度试验结果见表2。定量下限、低、中、高浓度的PF溶液日内和日间精密度RSD均小于1.92%,符合HPLC的分析要求。

3.4 回收率试验回收率试验结果见表3,表明该方法回收率符合方法学要求。

表3 PF在PF-PLC胶束中的回收率(n=3)

3.5 稳定性试验稳定性试验结果如表4所示。结果显示RSD均小于1.93%,表明PF在该条件下稳定性较好。

表4 PF在不同时间下的稳定性(n=5)

3.6 PF-PLC胶束不同浓度的吸收特性以十二指肠为灌流部位,分别配制含PF 20、10和5 μg·mL-1的PF原料药和PF-PLC胶束灌流液,按照“2.3.1”项下方法进行操作,分别进行在体肠吸收实验。结果如表5所示,PF原料药的肠吸收随其浓度的增加而有所增加,提示其吸收存在被动转运途径,但浓度的增加对肠吸收的影响并不显著(P>0.05)。由此可以说明PF在脂溶性差的情况下,单纯提高药物的浓度并不能达到有效提高被动转运的目的。PF-PLC胶束浓度的提高可显著增加PF的肠吸收(P<0.001,P<0.05),表明PLC胶束的形成可显著提高PF透过肠道屏障的能力。因此,PF-PLC胶束促进PF肠吸收可能与提高其被动转运能力有关。

表5 不同浓度PF和PF-PLC胶束的吸收情况

表6 维拉帕米对PF和PF-PLC胶束肠吸收影响

3.7 P-gp抑制剂对PF和PF-PLC胶束吸收的影响考察在十二指肠段中PF和PF-PLC胶束的吸收是否会受到P-gp外排的影响的研究中发现在灌流液中加入维拉帕米后发现,与单纯PF组比较,PF的吸收参数(Ka值和Peff值)虽然有增加的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);与PF-PLC胶束组比较,加入维拉帕米后差异也无统计学意义,表明维拉帕米的加入对PF和PF-PLC胶束在十二指肠的吸收均无明显影响。

4 讨论

无论是在临床实践中还是对于慢性病的长期治疗中,口服给药因具有更好地患者依从性、更低的成本和方便快捷的优点在诸多给药方式中占据重要地位[14]。药物经口服给药后通过胃肠道吸收入血,再经血液循环分布到全身组织器官,从而发挥疗效。小肠因其独特的生理结构,是口服给药最主要的吸收部位[15]。因此,药物的肠吸收在一定程度上可以反映药物经口服后的整体吸收情况。

目前,研究药物肠吸收的方法主要包括有体内法、在体法和离体法。其中在体单向肠灌流法因其更接近人体生理环境而被广泛用于吸收行为和机理的研究[16-18]。在本实验中,在体灌流的速度以0.2 mL·min-1进行单向灌流,低流速可模拟正常生理条件下肠蠕动的速度,对肠壁结构造成的影响小,使实验结果更加稳定、真实[19]。此外,在灌流的过程中,肠道在吸收药物的同时,也会吸收或排泄水分,从而导致灌流液的体积发生变化,使得测量结果出现偏差。因此需对灌流液的体积和密度等进行校正。有研究报道,酚红作为肠灌流实验的标志物时,会在一定程度上影响药物的吸收,甚至还可能与药物发生反应[20-21]。因此,本实验采用重量法代替经典的酚红法来测定灌流液的体积变化。以动力学参数Ka和Peff为指标,本研究通过大鼠在体肠灌流模型考察了不同浓度和加入P-gp抑制剂对PF、PF-PLC胶束在十二指肠的肠吸收特性的影响。对比PF和PF-PLC胶束肠吸收结果可见,随着浓度的增加,PF-PLC胶束在十二指肠的Ka和Peff值较PF均有不同程度的提高(P<0.01,P<0.05)。表明PLC胶束的形成对PF的肠吸收有所改善,且存在被动转运途径。这可能与PLC胶束提高被动转运的能力有关。

P-gp是ATP结合盒(ABC)转运蛋白的超家族成员之一,是许多药物的吸收、代谢和排泄的重要决定因素[22-24]。药物与其亲和力的大小反映了生物利用度的高低。维拉帕米作为P-gp抑制剂,可与其他药物联合使用,使药物外排减少,从而提高生物利用度[25]。本实验在灌流液中加入维拉帕米后发现,与单纯PF组比较,虽然有增加的趋势,但无明显的差异。同样,与PF-PLC胶束组比较,差异也无统计学意义,表明维拉帕米的加入对药物的吸收无显著影响。以上结果表明,PF-PLC胶束的吸收不受外排转运体的影响,这可能是生物利用度提高的原因之一。但其他P-gp抑制剂是否会对药物的吸收产生影响仍需进一步实验研究。

5 结论

综上所述,PF-PLC胶束在十二指肠的吸收明显优于PF。PF-PLC胶束改善肠道吸收的作用不仅是因为促进跨膜转运能力,而且可能是因为它不会被转运蛋白作为P-gp的底物分泌回肠腔。依据本研究结果判断,PF-PLC胶束的主要吸收方式是被动转运。因此,PF-PLC胶束可以口服来克服PF的生物利用度和吸收差的问题。由此可见,将口服生物利用度差的药物制成PLC胶束是改善其肠吸收的一种有效途径,对于提高中药制剂的口服生物利用度具有重要意义。