HS-SPME-GC-MS/MS结合ROAV值鉴定新疆库车小白杏的关键香气物质

赵彩，孙金奎，李甜，史学伟，程卫东，王斌

（石河子大学食品学院，新疆石河子 832000）

杏（Prunus armeniacaL.），为蔷薇科（Rosaceae）李亚科（Prunoideae）杏属（ArmeniacaMill）植物[1]。作为一种美味的水果，杏受到全世界消费者的喜爱，尤其在地中海、南非以及北美等地[2]。杏起源于中国新疆，适宜的气候和优越的地理环境使得新疆杏子的年产量居全国之首[3]。在众多杏种资源中，小白杏是新疆南疆地区种植最为广泛的杏子品种之一，其果皮呈鹅黄色、大小适中、皮薄肉厚、味甜多汁。并且小白杏具有极高的营养价值，平均每颗杏果中含有约25%的蛋白质，50%的粗脂肪以及丰富的维生素、有机酸和糖类等[4]。

小白杏除了滋味可口、营养丰富，还具有非常独特且浓郁的香气。这些香气来源于杏果中所含有的挥发性物质。先前的研究已从新疆主要种植的14种杏子品种中共检测出208种挥发性化合物，包括39种醇类、25种醛类、80种酯类、21种酮类、27种萜烯类以及其他浓度较低的香气物质[5]。周围等[6]也分析了6种杏中所含有的挥发性成分，在组成和含量上具有较大的差异。事实上，大多数的挥发性物质因其含量较低、香气阈值较高而不易被人体嗅觉器官所感知。只有少数呈香性较强的挥发性成分才能被人体感知到，这类物质被称为关键香气成分，其含量越高，香气越浓郁。

不同杏品种所含有的关键香气成分差异较大，这些关键性香气构成了该品种的特征性香气指纹。对小白杏中挥发性化合物进行定性和定量分析是找出其关键性香气物质的关键。然而，想要得到理想的分析结果，前提是对这些挥发性物质进行提取浓缩和富集。顶空固相微萃取（Headspace Solid Phase Microextraction，HS-SPME）属于固相微萃取技术的一种，该技术集萃取、浓缩、进样于一体[7]，与传统的液-液萃取等其他萃取技术相比，更加快速简便、准确有效。本文采用HS-SPME与气相色谱双质谱（Gas Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）结合的技术对小白杏中所含有的挥发性化合物进行提取与分析，将影响HS-SPME萃取效率的各因素进行条件优化，以期获得最佳的萃取条件和萃取效果。根据相对香气活性值（Relative Odor Activity Value，ROAV）鉴定出关键性香气物质，并对小白杏呈香属性指纹进行分析，为后续探索具有小白杏风味的产品研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

实验所用小白杏于2021年6月采自新疆库车县牙哈镇杏园。采用五点取样法，于果园的东西南北中五个方位选取五棵杏树，分别从杏树的上、中、下部位随机采摘成熟（可溶性固形物质量分数为13.7%～15.8%）、大小均一且无病虫害的新鲜小白杏。共收获300颗小白杏，放置于泡沫保温箱中，随后被立即送往实验室。

1.2 仪器与试剂

ME104E电子分析天平，美国Mettler Toledo；DF-101S恒温磁力搅拌器，河南予华；8890-7000 D气相色谱-三重四级杆质谱联用仪，美国Agilent；手动SPME进样器（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，75 μm CAR/PDMS，100 μm PDMS），美国Supelco。

2-辛醇（纯度GC≥98%），Sigma-Aldrich上海贸易有限公司；氯化钠和氯化钙（分析纯），天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 顶空固相微萃取条件优化

准确称取5.0 g杏肉于20 mL顶空瓶中，依次加入1.0 g氯化钠，5 mL饱和氯化钙溶液，1 μL 2-辛醇溶液（用正己烷稀释3倍后作为内标）和磁力转子后，将顶空瓶密封，将磁力搅拌器转速设置为300 r/min。选择三种常见涂层类型的萃取纤维，即三重混合涂层：聚二乙烯基苯/碳吸附剂/聚二甲基硅氧烷（Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS），灰色，50/30 μm；双重混合涂层：碳吸附剂/聚二甲基硅氧烷（Carboxen/Polydimethylsiloxane，CAR/PDMS），黑色，75 μm以及单一涂层：聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS），红色，100 μm。分别设置四个平衡萃取温度（35、45、55、65 ℃）和四个萃取时间（30、40、50、60 min），平衡时间设置为10 min。萃取完成后，立刻将萃取头插入GC-MS/MS进样口，230 ℃下解析5 min。

1.3.2 GC-MS条件

选择HP-Innowax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管色谱柱。进样口温度设置为230 ℃，载气为氦气（纯度99.999%），流量为1.0 mL/min，进样采用不分流模式。升温程序为初始温度40 ℃，保持5 min；先以2 ℃/min升温至68 ℃，然后以3 ℃/min升温至180 ℃，最后以16 ℃/min升温至230 ℃，保持1 min。

MS条件采用EI电离模式，电子能量为70 eV，离子源温度270 ℃，质量扫描范围为30～350。

1.3.3 挥发性化合物的定性与定量

将所测样品中分离出的未知物与NIST17.L数据库进行检索比对，初步筛选出匹配度大于75的化合物。利用数据库中每种化合物的保留指数（Retention Index，RI）进一步确定小白杏中所含有的挥发性成分。

小白杏中挥发性化合物的含量计算如下：

式中：

C1——目标化合物的含量，μg/kg；S1——目标化合物的峰面积；

S0——内标的峰面积；

C0——内标的含量，μg/kg。

1.3.4 关键香气化合物的分析

根据以下公式[8]计算香气活性值（Odor Activity Value，OAV）：

式中：

OAV——香气活性值；

C——挥发性化合物的含量，μg/kg；

T——该挥发性化合物的香气阈值，μg/L。

根据计算结果，规定OAV最大的香气化合物其相对香气活性值（ROAV）为100，其他挥发性化合物的ROAV计算如下[9]：

式中：

Ci——挥发性化合物的含量，μg/kg；

Ti——该挥发性化合物的香气阈值，μg/L；

Cmax——OAV最大的香气化合物的含量，μg/kg；

Tmax——OAV最大的香气化合物的香气阈值，μg/L；

ROAVmax——OAV最大的香气化合物的ROAV值。

关键香气化合物的判定依据为：ROAV≥1，该挥发性物质对小白杏整体风味有重要贡献，判定为关键性香气化合物；0.1≤ROAV＜1，该挥发性物质对小白杏整体风味有修饰作用，判定为修饰性化合物；ROAV＜0.1，该挥发性物质对小白杏整体风味无贡献，判定为潜在性香气化合物[8]。

1.3.5 小白杏呈香属性指纹分析

小白杏的香气分析由一个专业的感官评定小组进行，该小组包括10位成员（5名男性和5名女性，年龄22～31岁）。小组成员通过多次（至少三次）感官评估会议分析小白杏的香气特征，选择六个香气术语（即青草香、果香、椰子香、柑橘香、花香和松香）来描述杏子的风味特征。小组成员使用三点评分法（0分，不能感知；1分，香味较弱；2分，香味显著；3，香味强烈）对每个杏子样品的气味强度进行评分。

1.4 数据处理

使用SPSS 26.0软件进行数据处理，每组实验进行三次，结果以平均值±标准差表示。使用Origin 2018进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 顶空固相微萃取条件优化

2.1.1 DVB/CAR/PDMS（50/30 μm，灰色）涂层纤维的萃取条件优化

使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色）涂层的萃取纤维，设置四种不同的平衡萃取温度（35、45、55、65 ℃），在这四种温度下平衡样品10 min，接着在相同条件下萃取50 min。萃取完成后，将萃取头插入MS系统进行解析。结果如图1a所示，随着温度升高，峰面积增大，峰个数增多。当温度为65 ℃时，峰面积和峰个数达到最大。这表明，升温可以加快分子热运动，挥发性物质更容易释放出来，萃取效率增加[10]。

图1 DVB/CAR/PDMS涂层纤维萃取温度（a）与萃取时间（b）的优化Fig.1 Optimization of extraction temperatures (a) and times (b)by DVB/CAR/PDMS coated fiber

选择65 ℃为平衡萃取温度，设置四种不同的萃取时间（30、40、50、60 min），研究萃取时间对萃取效果的影响。当萃取时间为30 min和40 min时，峰面积和峰个数远远低于50 min。当萃取时间为60 min时，峰面积和峰个数又急速下降（图1b）。这可能是由于当萃取时间为50 min时，该萃取纤维（DVB/CAR/PDMS，50/30 μm）的吸附量已经达到饱和，继续延长萃取时间，导致萃取纤维的解析作用大于吸附作用，从而降低了萃取效率。萃取纤维对挥发性物质的吸附是一个动态变化的过程，只有当样品量、萃取纤维和顶空部分这三者之间达到动态平衡，才能保证吸附量达到最大[11]。综合考虑，当使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色）涂层的萃取纤维时，最佳的萃取条件为平衡萃取温度65 ℃，萃取时间50 min。

2.1.2 CAR/PDMS（75 μm，黑色）涂层纤维的萃取条件优化

使用75 μm CAR/PDMS（黑色）涂层的萃取纤维，设定萃取时间为50 min，研究不同平衡萃取温度（35、45、55、65 ℃）对萃取效率的影响（图2a）。结果表明，随着温度的升高，峰面积与峰个数先增大后降低。当萃取温度为55 ℃时，峰面积和峰个数均达到峰值。造成这种现象的原因在于当使用75 μm CAR/PDMS涂层的萃取纤维时，温度过高会降低萃取纤维涂层的分配系数，从而减小了挥发性物质的吸附量，同时分子质量较小的易挥发性成分再次从萃取纤维头上解析出来[12]，最终导致萃取效率降低。因此，选择55 ℃为最佳平衡萃取温度，设定不同萃取时间（30、40、50、60 min），研究其对萃取效果的影响（图2b）。结果表明，当萃取时间为50 min时，萃取效果最高，峰面积和峰个数最大。综合考虑，当使用75 μm CAR/PDMS（黑色）涂层的萃取纤维时，最佳的萃取条件为平衡萃取温度55 ℃，萃取时间50 min。

图2 CAR/PDMS涂层纤维萃取温度（a）与萃取时间（b）的优化Fig.2 Optimization of extraction temperatures (a) and times (b)by CAR/PDMS coated fiber

2.1.3 PDMS（100 μm，红色）涂层纤维的萃取条件优化

图3a研究了使用100 μm PDMS（红色）涂层的萃取纤维在四种平衡萃取温度（35、45、55、65 ℃）下对萃取效率的影响。当温度从35 ℃升至65 ℃时，峰面积和峰个数呈现先逐渐增加后降低的趋势，当温度为55 ℃时，峰面积和峰个数达到最大，故选择55 ℃为最适温度。图3b研究了当平衡萃取温度为55 ℃时，四种萃取时间（30、40、50、60 min）对萃取效率的影响。当萃取时间为50 min时，峰面积和峰个数达到最大，故选择50 min为最适萃取时间。综合考虑，当使用100 μm PDMS（黑色）涂层的萃取纤维时，最佳的萃取条件为平衡萃取温度55 ℃，萃取时间50 min。

图3 PDMS涂层纤维萃取温度（a）与萃取时间（b）的优化Fig.3 Optimization of extraction temperatures (a) and times (b)by PDMS coated fiber

2.2 最佳涂层纤维的选择

不同涂层的萃取纤维，其吸附和解析能力不同，只有选择适合待测样品的萃取纤维才能得到最佳的检测结果[13]。本文选择了三种常见的萃取纤维即50/30 μm DVB/CAR/PDMS（灰色），75 μm CAR/PDMS（黑色）与100 μm PDMS（红色）对小白杏中挥发性化合物进行提取，并结合GC-MS/MS进行分析。离子流图（图4）表明三种涂层纤维所萃取到的挥发性化合物在种类和浓度上有很大的差异。其中，共有22种挥发性物质被这三种涂层的萃取纤维同时萃取出来。9种化合物仅被50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取，11种化合物仅被75 μm CAR/PDMS萃取，3种化合物仅被100 μm PDMS萃取（图5a）。不同涂层的萃取纤维所提取到的挥发性化合物的类型也不同。在50/30 μm DVB/CAR/PDMS所萃取的化合物中醇类物质含量最高，其次是酯类化合物，这与100 μm PDMS涂层的萃取结果相同。当使用75 μm CAR/PDMS萃取纤维时，醛类化合物含量最高，酯类化合物其次（图5b）。综合考虑，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS进行小白杏中挥发性化合物的提取时，萃取效果最好，最佳的萃取条件为平衡萃取温度65 ℃，萃取时间50 min。

图4 三种涂层的萃取纤维所测挥发性化合物的离子流图Fig.4 Ion chromatogram of volatile compounds measured by three kinds of coated extracted fibers

图5 三种涂层萃取纤维所提取的挥发性化合物的韦恩图分析（a）与含量（b）Fig.5 Venn diagram analysis (a) and content (b) of volatile compounds extracted from three extraction fibers

2.3 小白杏中挥发性化合物的分析

采用HS-SPME-GC-MS/MS分析了小白杏中挥发性化合物的组成，共鉴定出46种挥发性化合物：包括8种醇类，8种醛类，13种酯类，5种酮类，7种萜烯类和5种其他类化合物（表1）。其中，醇类物质最为丰富（34.57%），其次为酯类（33.77%）和醛类物质（24.77%）。酮类，萜烯类和其他类挥发性物质占比非常少，总计仅为6.89%（图6）。

表1 小白杏中挥发性化合物的含量Table 1 Content of volatile compounds in Xiaobai apricot

图6 不同种类的挥发性化合物的百分比图Fig.6 Percentage diagram of different types of volatile compounds

如表1所示，在醇类物质中，含量最高的为芳樟醇（1 011.72 μg/kg），其次为α-松油醇（470.74 μg/kg），其他醇类化合物含量都相对较低。另外，芳樟醇作为一种天然香料，也广泛存在于其他新鲜的水果，如苹果[14]、芒果[15]和西柚[16]中。在醛类物质中，苯甲醛的含量最为丰富（957.34 μg/kg），其次是(E)-2-己烯醛（69.73 μg/kg）、糠醛（19.22 μg/kg）以及正己醛（11.31 μg/kg）。此外，兔耳草醛含量最低，仅为0.45 μg/kg。苯甲醛也是日本杏子品种中主要的挥发性物质，含量为305.40 μg/kg[17]，与本文的小白杏相比，含量较低。在C6化合物中，正己醛和(E)-2-己烯醛是杏子中重要的香气化合物，赋予其草本的香气[18]。酯类和内酯类化合物是使杏子具有果香味的主要物质[19]。在酯类化合物中，2-糠酸乙酯的含量最高，为1 076.16 μg/kg。而γ-癸内酯是小白杏中最丰富的内酯类物质，含量为276.13 μg/kg。在先前的研究中，富士苹果中的酯类物质也是主要的香气组分[20]。

在杏子发育过程中，前期主要积累醇类、醛类和萜烯类物质，成熟时则以酮类和酯类物质为主。杏果实中挥发性香气也由己醛和己烯醛等清香型物质转变成酯类等果香型或酮类等花香型化合物[21]。在杏子成熟后期，脂氧化酶活性降低，这可能与C6醛类物质的含量降低有关[22]。在小白杏中，二氢-β-紫罗兰酮（49.96 μg/kg）是最丰富的酮类物质，β-紫罗兰酮（39.32 μg/kg）其次。而在“Tokaloglu Yalova”杏中，β-紫罗兰酮（151.00 μg/kg）却是含量最高的酮类物质。在土耳其的杏子品种中，与其他类的化合物相比，烯萜类物质含量较低（104.90～213.60 μg/kg）[23]，在本研究中，其含量与小白杏中萜烯类物质的总含量相似。小白杏中浓度最高的萜烯类物质为d-柠檬烯，其含量为33.00 μg/kg。在其他类物质中，茶螺烷最为丰富（37.94 μg/kg），该物质是一种螺环氧化物，具有天然的红茶香气。

2.4 小白杏中香气化合物的ROAV分析

事实上，并不是所有的挥发性物质都对小白杏的整体风味作出贡献，仅仅依靠物质的含量来判断其重要性的方法具有很大的局限性。香气阈值是描述风味贡献时的一个重要因素，表示人们开始闻到某种挥发性物质的最低浓度。本研究利用ROAV表征了对小白杏风味轮廓起重要贡献的关键香气物质。

小白杏中β-紫罗兰酮的含量虽然与其他香气物质的含量相比较低，但因其具有非常低的香气阈值，因此OAV最大。如表2所示，根据香气化合物的ROAV，共筛选出6种对小白杏香气具有重要贡献的关键香气物质（ROAV＞1）。除β-紫罗兰酮之外，γ-癸内酯的ROAV也非常高（ROAV=57.45），赋予小白杏强烈的椰子香。其次是二氢-β-紫罗兰酮（ROAV=11.44）、芳樟醇（ROAV=9.26）、月桂烯（ROAV=4.34）和α-紫罗兰酮（ROAV=1.44），这些物质赋予小白杏果香、花香以及木香等。另外，有9种挥发性物质对小白杏的香气轮廓起修饰作用（0.1＜ROAV＜1）。它们对小白杏中的青草香、黄瓜味、蜂蜜味、桃香以及果香等也具有一定的贡献。

表2 小白杏中香气化合物的ROAV分析Table 2 ROAV analysis of aroma compounds in Xiaobai apricot

2.5 小白杏呈香属性指纹分析

选择新疆杏子种植基地另一种受欢迎的品种（吊干杏）作对照，小白杏和吊干杏的香气轮廓由青草香、果香、椰子香、柑橘香、花香和松香这六种香气所描述，进行呈香属性指纹分析（图7）。与吊干杏相比，小白杏具有更浓郁的青草香、果香、椰子香、柑橘香和花香，得分更高。值得注意的是，小白杏在“花香”上的得分几乎满分，这可能与小白杏中所含有的β-紫罗兰酮（ROAV=100）有关。另外，吊干杏的“松香”得分比小白杏的得分更高，但从整体的香气轮廓来说，松香远远不如其它香气强烈。小白杏中的青草香和柑橘香与其他香型相比，得分较低。这说明小白杏在成熟期时，其香气化合物主要由酯类和酮类物质为主。除“花香”以外，吊干杏的整体香气较弱。

图7 杏子的呈香属性指纹分析Fig.7 The aroma fingerprint of apricot

3 结论

在进行小白杏香气提取时，对三种不同涂层的萃取纤维，即DVB/CAR/PDMS（灰色，50/30 μm）、CAR/PDMS（黑色，75 μm）和PDMS（红色，100 μm）进行了条件优化，最终选择使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取纤维，萃取温度65 ℃，萃取时间50 min，此时萃取效率最好，峰面积最大，峰个数最多。

采用HS-SPME-GC-MS/MS技术鉴定出小白杏中共含有46种挥发性物质，包括8种醇类、8种醛类、13种酯类、5种酮类、7种萜烯类和5种其他类化合物。其中醇类物质含量最高（34.57%），其次是酯类（33.77%）和醛类化合物（24.77%）。芳樟醇，苯甲醛，2-糠酸乙酯，二氢-β-紫罗兰酮，d-柠檬烯以及茶螺烷分别是含量最为丰富的醇类、醛类、酯类、酮类、萜烯类以及其他类别的化合物。利用ROAV表征了小白杏的整体香气轮廓。除β-紫罗兰酮（ROAV=100）之外，γ-癸内酯、二氢-β-紫罗兰酮、芳樟醇、月桂烯和α-紫罗兰酮的ROAV都大于1，被认为是关键的香气物质，这些物质赋予小白杏浓郁的花香、果香以及木香。另外，本研究分析了小白杏的呈香属性指纹。与吊干杏相比，小白杏的青草香、果香、椰子香、柑橘香以及花香更为强烈，只有木香较弱。