灰树花多糖对多囊卵巢综合征大鼠症状的改善作用
2023-09-09种超杰吴亚琪董哲文李婉萤钟淑媚王子娴周燕园宋家乐
种超杰,吴亚琪,董哲文,2,李婉萤,钟淑媚,王子娴,周燕园,5*,宋家乐,6,7*
(1.桂林医学院药学院,广西桂林 541199)(2.沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳 110016)(3.桂林医学院公共卫生学院,广西桂林 541199)(4.柳州市人民医院临床营养科,广西柳州 545026)(5.广西糖尿病系统医学重点实验室,广西桂林 541199)(6.广西环境暴露组学与全生命周期健康重点实验室,广西桂林 541101)(7.桂林理工大学国家母婴乳品健康工程技术研究中心南亚分中心,广西桂林 541004)
多囊卵巢综合征(Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS)是育龄妇女期最常见的内分泌性疾病。据统计,全世界育龄期妇女PCOS的发病率高达5%~10%[1]。在中国,19~45岁的汉族女性人群中PCOS的发病率为5.6%[2]。临床上,PCOS的主要特征为高雄激素血症,排卵功能障碍,以及超声下卵巢呈现多囊形态[3]。肥胖(尤其是腹部肥胖)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、心血管疾病均与PCOS的发生有较强的相关性[4]。研究表明,PCOS患者体内存在异常的氧化应激水平,而这一生理事件被认为是促进PCOS病理发展的潜在诱因之一[5]。
二甲双胍(Metformin,Met)是一种噻唑烷二酮衍生物,是临床PCOS治疗的常用药物之一。Met可以提高PCOS患者对胰岛素的敏感性,改善卵巢排卵功能[6]、抑制卵巢雄激素的合成[7],但长期服用Met会造成恶心、呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道反应以及乳酸中毒和肝肾损害[8]等不良反应。
灰树花(Grifola frondosa),又称为“舞茸”,属于担子菌纲,多孔菌目,多孔菌科,树花属,是一种我国传统食药两用真菌[9]。目前,对灰树花有效成分的研究主要集中于其多糖成分。已有的研究报道指出,灰树花多糖(Grifola frondosaPolysaccharide,GFPS)具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化、免疫调节和调节肠道菌群等多方面的活性[10]。GFPS不仅可以改善高脂饲料(45%脂肪供能)诱发高脂血症大鼠的脂代谢紊乱[11],还可以降低高脂肪与高胆固醇混合饮食仓鼠血清中甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、谷胱甘肽水平,并升高过氧化氢酶水平[12]。本文拟采用来曲唑建立PCOS大鼠模型,通过观察GFPS对PCOS大鼠动情周期、性激素水平、脂质代谢及氧化应激水平的改善作用,为GFPS用于临床治疗PCOS药物的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
GFPS多糖购自西安瑞迪生物科技有限公司(主要由葡萄糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖组成,其摩尔比依次为3.30:0.12:0.038:0.030:0.018:0.008:0.011);来曲唑(Letrozole,B25470)购自上海源叶生物科技有限公司;Met(M2009)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;羧甲基纤维素(Carboxymethyl Cellulose,CMC,S14015)购自西陇科学股份有限公司;巴氏染液(G1612)购自北京索莱宝科技有限公司;苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色试剂盒(C01055)和cDNA逆转录试剂盒(D7178M)购自上海碧云天生物技术有限公司;Trazol试剂(DP424)和SuperReal荧光定量试剂盒(FP205-2)购自北京天根生化科技有限公司;雌二醇(Estradiol,E2,MM-0575R1)、睾酮(Testosterone,T,MM-0577R1)、黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH,MM-0624R1)、卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH,MM-70867R1)ELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司;TC(A111-1-1)、TG(A110-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C,A113-1-1)和高密度脂蛋白胆固醇(High-Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C,A112-1-1)试剂盒购自江苏爱迪生生物科技有限公司;丙二醛(Malonaldehyde,MDA,A003-1-2)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD,A001-3-2)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
Allegra 64R高速冷冻离心机,美国Beckman Coulter有限公司;Eppendorf 5424R型冷冻离心机,德国Eppendorf公司;Leica DM4B显微镜,德国徕卡仪器有限公司;ELx808酶标仪,美国BioTek公司;KZ-II高速组织研磨仪,武汉塞维尔生物科技有限公司;ProFlex梯度PCR仪和Quant StudioTM 6 Flex PCR仪,美国Thermo Fisher科技公司。
1.3 实验动物
总6周龄SPF级雌性SD大鼠32只(190~220 g)购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(生产许可证号SYXK(桂)2019-0004)。所有大鼠饲养于桂林医学院公共卫生学院SPF级动物房(单位许可证号:SCKY(桂)2020-0005),标准光照/黑暗(12 h/12 h)循环条件下饲养,自由采食并提供清洁饮水。
1.4 实验方法
1.4.1 造模与分组
将大鼠随机分为正常组(n=8)、PCOS组(n=8)、Met组(n=8)、GFPS组(n=8)。正常组每日灌胃生理盐水,PCOS组每日灌胃1 wt% CMC混悬液(含来曲唑1 mg/kg),Met组每日分别灌胃1 wt% CMC混悬液(含来曲唑1 mg/kg)和Met (265 mg/(kg·d))[13,14],GFPS组每日分别灌胃1 wt% CMC混悬液(含来曲唑1 mg/kg)和GFPS (600 mg/(kg·d))[15],每只大鼠每日灌胃1 mL,连续灌胃21 d后取材用于后续实验。本动物实验方案已通过桂林医学院动物伦理委员会审查批(GLMC201813009)。
1.4.2 实验动物动情周期的观察
以阴道上皮细胞分类染色法观察实验动物的动情周期[13,14]。无菌棉签沾取少量生理盐水于大鼠阴道内壁顺时针旋转,将采集的细胞均匀涂抹于载玻片上晾干,95vol%乙醇固定30 min。根据染色试剂盒说明书操作进行巴氏染色观察与记录。
1.4.3 大鼠脏器质量测定和卵巢组织形态学观察
实验结束后,CO2麻醉处死大鼠,腹主动脉取血。使用高速冷冻离心机在4 ℃和3 000 r/min条件下离心10 min制备血清。冰上快速分离卵巢、子宫和内脏脂肪(腹部脂肪、肾周脂肪、子宫周脂肪),并算内脏脂肪相对质量。一侧卵巢经10%(V/V)福尔马林溶液固定行石蜡包埋切片(4 μm)并进行HE染色,显微镜下观察各组大鼠卵巢组织病理学变化。
式中:
A——内脏脂肪相对质量;
m1——内脏脂肪质量,g;
m0——大鼠体质量,g。
1.4.4 血清生化指标的检测
取1.4.3中制备的血清,按照对应ELISA试剂盒说明操作,检测大鼠血清中FSH、LH、E2、T水平,并计算LH/FSH比值;检测血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、MDA及SOD水平。
1.4.5 qRT-PCR技术检测PCOS大鼠卵巢组织中抗氧化基因酶的mRNA表达
卵巢组织(20 mg)用生理盐水清洗血污后,Trazol试剂提取总RNA。定量RNA纯度后使用SYBR Green定量聚合酶链式反应试剂盒检测抗氧化基因酶Sod1(5′-3′:CGGATAAGAGAGGATGTT,3′-5′:TAGTA CGGCCAATGATGGAATG),Sod2(5′-3′:AGCGTG ACTTTGGGTCTTT,3′-5′:AGCGACCTTGCTCCTT ATTG),Cat(5′-3′:CAGAGGAAAGCGGTCAAGAA,3′-5′:CATTCTTAGGCTTCTGGGAGTT)和Gpx3(5′-3′:GACATCCGCTGGAACTTTGA,3′-5′:CCATCTTGACGTTGCTGACT)的表达水平,以Gapdh(5′-3′:GACATGCCGCCTGGAGAAAC,3′-5′:AGCCCAGGATGCCCTTTAGT)为内参。在总反应体系加入cDNA模板(1 μL),2×superReall PeMiK Pus(10 μL),50×ROX Rltene Dye(0.4 μL),上、下游引物各0.6 μL,最后添加无酶水(7.4 μL)至总体积20 μL,PCR反应程序为:95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,共40个循环。每个反应设置3个重复,采用2-△△Ct法计算样品中各基因的相对表达量[16]。
1.4.6 数据处理与统计学分析
采用SPSS 25.0统计软件进行分析,所有实验数据以结果以均值(Means)±标准偏差(SD)表示。数据统计方法使用单因素方差分析(ANOVA)进行两两比较,组间比较采用最小显著性差异法(Least Significant Difference,LSD)进行显著性差异检验,方差不齐采用Tamhane T2检验,P<0.05有统计学意义。Graphpad Prism9进行绘图。
2 结果与讨论
2.1 GFPS对PCOS大鼠动情周期的影响
雌性SD大鼠的动情周期一般为4~5天[17],其阴道上皮细胞的类型可分为存在大量椭圆形有核上皮细胞的动情前期,存在大多数不规则角化上皮细胞的动情期,存在不规则角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞的动情后期和以白细胞为主的动情间期等4个典型阶段[18]。在用来曲唑诱导的PCOS大鼠经典模型中,可以观察到模型大鼠伴有激素水平的异常及动情周期紊乱等与人PCOS类似的临床症状[19]。
如图1a所示,在整个实验期间正常组大鼠呈现规律的动情周期,而PCOS大鼠的动情周期多处于后期和间期,出现典型动情周期紊乱情况(图1b~e)。本次研究中所观察到的PCOS大鼠动情周期长时间处于间期的现象与Wang等[20]所报道的PCOS大鼠动情周期紊乱较为一致。GFPS和Met分别处理后,PCOS大鼠动情周期逐渐趋于正常,提示GFPS能够有效改善PCOS大鼠所出现的动情周期紊乱。PCOS大鼠动情周期紊乱的原因与下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-Pituitary-Ovarianaxis,HPOA)的失衡相关,HPOA的失衡,抑制卵巢E2、FSH水平的产生,导致PCOS大鼠失去规律的动情周期,影响卵泡发育的成熟[21]。GFPS通过改善PCOS大鼠的性激素水平有效的改善了PCOS大鼠动情周期紊乱。Li等[22]的研究表明从灰树花子实体提取的多糖主要单糖组成为葡萄糖(Glc)、少量的甘露糖(Man)和半乳糖(Gal),三者间的摩尔比为15.2:2.8:1.0,这与本次实验中我们所使用GFPS的单糖构成较为接近。此外,传统药食两用植物石斛多糖(主要单糖构成为Glc、Man和Gal,其中Glc占比66.2%)也能够纠正来曲唑诱导的PCOS大鼠紊乱的动情周期[23]。
图1 GFPS对PCOS大鼠阴道上皮细胞(a)及动情周期(b~e)的影响Fig.1 Effect of GFPS on vaginal epithelial cells (a) and estrous cycle (b~e) in PCOS rats
2.2 GFPS对PCOS大鼠子宫、卵巢形态和卵巢病理学变化的影响
PCOS患者因体内存在过高的雄激素水平,造成卵巢形态异常[24],同时引发子宫炎症和血管分布异常等病理现象[25]。与正常组相比,PCOS大鼠卵巢组织和子宫普遍苍白、供血减少,卵巢包膜增厚且体积增大这一结果与我们前期研究一致[13,14]。GFPS和Met分别干预后上述症状明显改善(图2a)。HE染色结果显示,正常组大鼠卵巢中可见多个黄体和不同阶段发育的卵泡,少见囊性扩张的卵泡(图2b)。与正常组相比,PCOS大鼠多个卵泡呈囊性扩张,黄体明显减少、颗粒细胞层变薄,提示无排卵,这与Rajan等[26]所报道的对卵巢的研究结果一致。经GFPS和Met分别干预后,PCOS大鼠卵巢组织内囊泡减少,黄体增多、颗粒细胞层增厚,部分可恢复至正常卵泡形态。研究显示铁皮石斛多糖也可减少PCOS大鼠囊性卵泡、增加黄体数量,增厚卵巢颗粒层[27],而石斛多糖主要由Glc和Man构成[28]。这一研究也佐证了富含Glc的GFPS能显著改善PCOS大鼠的卵巢病理症状。
图2 GFPS对PCOS大鼠子宫和卵巢形态(a)及卵巢病理学变化(b)的影响Fig.2 Effect of GFPS on uterine and ovarian morphology (a) and ovarian pathological changes (b) in PCOS rats
2.3 GFPS对PCOS大鼠体重、内脏脂肪及脂质水平的影响
PCOS患者多伴有肥胖,这不仅会加重IR和代偿性高胰岛素血症,增加脂肪的生成,同时肥胖使卵泡膜细胞对黄体生成素的刺激敏感,造成高雄激素血症[29,30],这些都会阻碍PCOS患者卵泡发育[31]。内脏脂肪的堆积与代谢综合征、2型糖尿病和心血管疾病的发生相关,它是反映疾病严重程度的指标[32,33]。本研究对比各组大鼠体质量和内脏脂肪相对质量发现(图3),各组大鼠初始体重无显著性差异,至21 d实验结束时,PCOS大鼠体重和内脏脂肪相对质量较正常组显著升高了21.79%和62.22%(P<0.01)。Met组大鼠体重和脂肪相对质量较PCOS组分别下降了12.20%和23.67%(P<0.01),GFPS组大鼠的体重和脂肪相对质量较PCOS组分别下降了9.20%和24.08%(P<0.01)。研究发现,主要构成为Glc的乌龙茶多糖[34],能显著降低高脂饮食大鼠体重并减少其内脏脂肪堆积[35]。铁皮石斛多糖也能降低高脂饮食所造成的小鼠内脏脂肪组织中的炎症水平[36],这有力的佐证了GFPS对PCOS大鼠体重和内脏脂肪具有改善作用。
图3 GFPS对PCOS大鼠体重及内脏脂肪相对质量的影响Fig.3 Effect of GFPS on body weight and relative mass of visceral fat in PCOS rats
进一步检测大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平发现(图4),PCOS大鼠血清TC、TG、LDL-C水平较正常组分别升高了2.48倍、1.87倍和4.97倍(P<0.01),HDL-C下降了50.00%(P<0.01)。Met组大鼠血清中TG、LDL-C降低了33.94%、36.81%(P<0.01),HDL-C升高了2.04倍(P<0.01);GFPS组大鼠血清中TC、TG、LDL-C分别降低了82.46%、66.94%、83.71%(P<0.01)。这与Pan等[37]所研究GFPS降低高糖高脂饲料饮食大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平降低的研究结果一致。但值得注意的是,我们的研究结果显示GFPS对PCOS大鼠血清HDL-C水平无显著改善作用(P>0.05),且Guo等[38]研究结果也提示GFPS对糖尿病小鼠血清中HDL-C水平无显著性影响。这表明GFPS通过降低PCOS大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平从而发挥调节脂质代谢紊乱的作用。
图4 GFPS对PCOS大鼠血清中(TC,TG,LDL-C和HDL-C)水平的影响Fig.4 Effect of GFPS on serum levels of (TC, TG, LDL-C and HDL-C) in PCOS rats
2.4 GFPS对PCOS大鼠性激素水平的影响
性激素紊乱作为PCOS患者的典型症状其具体的机制可能与HPOA轴失衡和芳香化酶功能失调有关。正常生理情况下,促性腺激素释放激素刺激垂体前叶分泌LH和FSH。下丘脑的促性腺激素释放激素脉冲频率增加会刺激LH的合成,导致LH/FSH比率升高[39]。LH进一步刺激卵泡膜细胞合成雄烯二酮,FSH通过芳香化酶活性影响雄烯二酮向雌二醇的转化,而来曲唑抑制了芳香化酶活性,导致卵巢中雄激素升高,雌激素下降[40]。卵巢激素水平的紊乱会导致排卵障碍,进一步引发月经生理周期的紊乱并造成不孕症[41]。
如图5示,PCOS大鼠血清中激素T、LH和LH/FSH比值较正常组升高了20.59%、23.56%和69.39%(P<0.01),E2和FSH水平则分别下降了26.25%、37.18%(P<0.01),这些激素水平的变化与Ndeingang等[42]采用相同造模方法的PCOS大鼠T、LH水平升高、E2降低的研究结果一致。相比PCOS模型组,Met组大鼠的T、LH水平下降了17.69%和22.87%,E2升高了31.30%(P<0.01);GFPS组大鼠血清T、LH及LH/FSH比值分别下降20.48%、14.57%和23.63%(P<0.01),E2和FSH水平则分别升高50.23%和15.00%(P<0.05)。此外,药食同源类石斛多糖、黄芪多糖也降低了PCOS大鼠血清T水平、升高了PCOS大鼠血清E2水平[24,43],而多项关于黄芪多糖的结构研究表明其主要由Glc构成[44],这为GFPS能够改善PCOS大鼠异常的性激素水平提供了有力支撑。
图5 GFPS对PCOS大鼠血清激素(T、LH、FSH和E2)及LH/FSH比值的影响Fig.5 Effect of GFPS on serum hormones (T, LH, FSH and E2)and LH/FSH ratio in PCOS rats
2.5 GFPS对PCOS大鼠血清中MDA及SOD水平的影响
氧化应激在PCOS发病机制中发挥着关键作用[45]。MDA、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等是评估氧化应激损伤重要的生物标志物[46],PCOS患者中的高雄激素血症、肥胖、胰岛素抵抗会引起卵巢中氧化应激水平的异常[47],主要表现为抗氧化酶水平下降,MDA水平升高[48]。本研究中,PCOS组大鼠血清中MDA水平较正常组升高了2.57倍,血清中SOD水平较正常组降低了5.85%(P<0.05,图6)。这与Haslan等[49]所报告的来曲唑诱导PCOS大鼠血清中MDA及SOD水平变化趋势较为一致。而GFPS和Met干预后,MDA水平较PCOS组分降低了43.52%和38.87%(P<0.01),SOD水平分别升高了9.90%和6.10%(P<0.01)。Kou等[50]发现GFPS能降低糖尿病大鼠血清中MDA,升高SOD水平,从而改善氧化应激水平。上述结果支持了GFPS能够改善PCOS大鼠血清中氧化应激水平这一结论。
图6 GFPS对PCOS大鼠血清中MDA与SOD水平的影响Fig.6 Effect of GFPS on the serum levels of MDA and SOD in PCOS rats
2.6 GFPS对PCOS大鼠卵巢组织中抗氧化基因酶(Sod1、Sod2、Cat和Gpx3)表达的影响
研究显示PCOS患者血清中SOD、GPx、CAT等抗氧化酶水平是显著下降的[51]。多糖具有提高抗氧化酶活性、消除自由基、抑制脂质过氧化的作用,可以减少组织或器官中氧化应激损伤[52,53]。为了进一步探索GFPS对PCOS大鼠氧化应激的影响,我们检测了PCOS大鼠卵巢组织中Sod1、Sod2、Cat和Gpx3抗氧化基因酶的mRNA表达。如图7所示,PCOS组织中Sod1和Cat的mRNA表达水平较正常组降低了26.91%、35.06%(P<0.05),Sod2、Gpx3的mRNA表达水平较正常组降低了72.09%、72.72%(P<0.01)。Met干预后的PCOS大鼠卵巢组织中Sod1、Cat、Gpx3的mRNA表达水平较PCOS组显著提高3.90、1.93、3.19倍(P<0.01),Sod2的mRNA表达水平提高了63.90%(P<0.05)。GFPS组大鼠卵巢组织中Sod1、Sod2、Gpx3的mRNA表达水平分别较PCOS组提高了3.86、3.16和2.75倍(P<0.01),Cat的mRNA表达水平提高了1.57倍(P<0.05)。研究提示经酶解处理提取的灰树花多糖具有α糖苷键构型,主要单糖由Man、Glc和Gal构成,摩尔比为1.00:16.36:5.25,其具有的三螺旋立体构型,会使抗氧化活性更高[54],这也提示了GFPS对PCOS大鼠机体的氧化应激状态具有改善作用。
图7 GFPS对PCOS大鼠卵巢中抗氧化基因酶(Sod1、Sod2、Cat和Gpx3)mRNA水平的影响Fig.7 Effect of GFPS on the mRNA levels of antioxidant gene enzymes (Sod1, Sod2, Cat and Gpx3) in the ovaries of PCOS rats
3 结论
本研究结果表明,GFPS能够通过改善PCOS大鼠血清中性激素水平,改善PCOS大鼠动情周期的紊乱并促进PCOS大鼠卵泡的成熟和发育。同时,GFPS处理还能降低PCOS大鼠体重的增长,减少其内脏脂肪相对质量,改善PCOS大鼠血清脂质代谢水平。此外,GFPS也通过上调PCOS大鼠卵巢组织中抗氧化基因酶(Sod1、Sod2、Cat和Gpx3)的基因表达水平来改善PCOS大鼠氧化应激状态(即升高了血清中的SOD水平,并降低了血清MDA水平)。上述结果充分证明了GFPS对PCOS大鼠的症状具有较好的改善效果,具体的作用机制可能与其参与调控PCOS大鼠的脂质代谢以及参与对抗氧化应激所导致的机体损伤有一定的关系。本研究同时也为GFPS用于临床辅助治疗PCOS提供了较为有力的研究证据。