盐胁迫协同抗坏血酸对芸豆萌发富集γ-氨基丁酸的影响

于海燕，廖晗雪，陈臣，田怀香

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

芸豆（Kidney Bean），生物学名菜豆（Phaseolus vulgarisL.），又称四季豆、腰豆等。2019年12月，据联合国粮农组织统计，全球芸豆年种植面积约有3.7×107hm2，总产量约为3.1×107t，其中我国每年种植面积在8.1×105hm2左右，平均年产量为1.3×106t，居世界第五[1]。芸豆具有很高的食用和药用价值，富含膳食纤维、蛋白质和多种矿物质元素[2]。目前芸豆主要作为日常菜品和煮粥、煲汤等方面的食材，深加工食品类少，开发利用率较低。萌发可以增加谷物和豆类蛋白质的生物利用度以及减少有害物质、抗营养因子，同时产生GABA等生物活性物质，使其营养组成和感官品质都得以改善[3,4]。因此发芽芸豆及其制品在国内外主食行业前景广阔，如生产富GABA营养粉、功能饮料等[5]。

GABA是一种非蛋白质氨基酸，能够通过降低神经元的活性避免神经细胞过度兴奋，并能避免产生焦虑的电信号传达到大脑的相关位点，因而具有缓解焦虑、安神助眠的作用[6]。随着年龄以及外界环境压力的增加，人体内GABA含量日益减少，特别是上班族、学生、运动员等长时间处于高压环境的人群更容易缺乏GABA，产生焦虑、疲倦、忧虑等情绪，因此从食品中补充GABA对人体健康具有重要意义[7]。GABA广泛分布于糙米、大豆、藜麦等多种植物中，但是含量较低（0.03～3.35 mg/g FW[8]），不能满足每人每天30～100 mg的摄入量，由此GABA的富集方法受到广泛关注[9]。

植物实现GABA富集的主要途径为GABA支路，即谷氨酸在GAD催化下脱去α-羧基生成GABA，再经GABA转氨酶催化为琥珀酸半醛，最后通过脱氢以琥珀酸形式进入三羧酸循环，其中GAD是GABA合成的限速酶[10,11]。在盐胁迫、高H+浓度、低氧低温和机械损伤等逆境条件下，植物体内GABA含量明显升高[12]，并且植物在不同胁迫条件下GABA积累程度和相应时间的差异表明不同胁迫诱导的GABA积累机制不同，因此植物体中GABA在逆境胁迫下的动态变化机制有待具体研究。目前，通过控制籽粒发芽的条件从而激活水解酶类富集GABA已经成为当前发芽谷物的研究热点，如张文刚等[13]利用谷氨酸钠和抗坏血酸协同处理藜麦，GABA积累量达到对照组的2.26倍；华艳[14]优化了糙米发芽富集GABA的培养液组分（谷氨酸、氯化钙、磷酸吡哆醛、赤霉素），GABA积累量可达158.94 mg/100 g。目前已有报道主要对湿热加工[15]和发酵[16]富集芸豆GABA以及芸豆萌发期间营养物质变化[17]做了初步探讨，但是有关芸豆在外源因子协同处理下萌发富集GABA的研究较少。

本研究以芸豆为原料，通过单因素和Box-Behnken试验优化得到芸豆富集GABA的最佳工艺参数，并初步探究不同外源因子胁迫芸豆萌发富集GABA机理，为芸豆富集GABA研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芸豆：小白芸豆，购自云南市，参考GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》测得芸豆谷氨酸含量为（3.35±0.02）g/100 g，实验前储存于室温通风处；GABA标准品、无水乙醇、苯酚、次氯酸钠、氯化钙、抗坏血酸、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，上海泰坦科技股份有限公司；2-巯基乙醇，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；磷酸吡哆醛，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；L-谷氨酸（BR），国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸，生工生物工程（上海）股份有限公司；L-谷氨酸钠，上海阿达玛斯试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MEMMERT培养箱，赛微生物技术有限公司；DHG-9145恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；UV-200紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；ME104E电子天平、FiveEasy Plus台式pH计，梅特勒-托力多仪器有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机，湘仪（湖南）离心机仪器有限公司；小型磨粉机，GIANXI山点水公司；FD-2冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 芸豆萌发工艺流程

芸豆→消毒→清洗→浸泡→加入外源因子→萌发→清洗→发芽芸豆

操作要点：挑选成熟饱满、大小一致且无损坏的芸豆，用75%（V/V）乙醇浸泡1 min消毒后清洗干净，加入3～5倍的去离子水25 ℃（避光）浸泡12 h[17]。浸泡后的芸豆种子用无菌纱布包裹放入培养皿，加入含不同浓度外源因子的培养液，用量以浸没纱布为宜，于培养箱中25 ℃进行培养，每隔6 h取一次样，选择样品中GABA含量最高时的萌发时间作为后续处理时间。培养期间保持充足的氧气和纱布的湿润，芸豆萌发完成后洗净并冷冻干燥24 h，打粉过60目筛后置于-16 ℃条件下待测。

1.3.2 萌发培养液中外源因子的确定

每组萌发实验用30 g左右芸豆，分别加入五种外源因子谷氨酸钠（Monosodium Glutamate，MSG）、氯化钠（Sodium Chloride，NaCl）、氯化钙（Calcium Chloride，CaCl2）、抗坏血酸（Ascorbic Acid，AsA）和磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5-Phosphate，PLP），同时进行芸豆去离子水萌发的对照试验。所有培养液现用现配，每个萌发试验进行3个重复。以GABA质量分数为指标，考察MSG溶液质量浓度（1、2、3、4、5 g/L）；NaCl溶液浓度（50、100、150、200、250 mmol/L）；CaCl2溶液浓度（2、4、6、8、10 mmol/L）；AsA溶液质量浓度（1、2、3、4、5 g/L）；PLP（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）对萌发芸豆中GABA含量的影响，确定显著影响芸豆GABA含量的主要外源因子，并得到Box-Behnken试验范围。

1.3.3 Box-Behnken试验优化萌发条件

在单因素实验结果基础上，利用3因素3水平Box-Behnken试验优化芸豆的萌发条件：MSG浓度（A）、CaCl2浓度（B）和AsA浓度（C），具体参数见表1。

表1 响应面设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.4 GABA含量的测定

GABA含量的测定参考张珺等[18]。GABA标准曲线的绘制：将GABA标准品用60%（V/V）乙醇溶解，配制0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL标准品溶液，分别取3 mL标准品，每组添加6 mL 7.5%（V/V）次氯酸钠（有效氯≥10%（V/V）），2 mL 6%（V/V）苯酚溶液，并用0.10 mol/L四硼酸钠调pH值9.0，避光放置30 min后于635 nm处测定吸光度。得到GABA的标准曲线为y=6.95x-0.014 7，R2=0.992 8，y为吸光度，x为标准品浓度。样品中GABA含量测定：取干燥芸豆样品粉末与60%（V/V）乙醇以1:10的比例混合，150 r/min、60 ℃下振摇2 h后在5 000 r/min条件下离心5 min，上清液为样品GABA待测提取液。取3 mL提取液按以上标准曲线测定的方法测定吸光度。

1.3.5 GAD活性测定

GAD的提取与活性测定参考Bai等[19]。GAD粗酶提取：芸豆粉和预冷磷酸钾缓冲溶液（pH值5.8、0.066 7 mol/L，含2 mmol/L 2-巯基乙醇，2 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L PLP）以1:5比例混合，涡旋振荡后置于冰水浴中提取1.5 h，最后10 000g冷冻离心20 min，取出上清液待测。GAD酶测定：反应体系含GAD粗酶液0.2 mL，1%（m/V）L-谷氨酸溶液（pH值4.7）0.1 mL。混合液置于40 ℃水浴2 h，90 ℃水浴5 min终止反应后测定GABA含量。1个酶活力单位定义为每克芸豆在40 ℃下每小时生成1 mg GABA（由添加的L-谷氨酸生成）。

1.3.6 数据分析

每个实验重复3次，取平均值，结果以干基表示。采用SPSS 21.0进行单因素方差分析与显著性差异分析，运用Origin 9.0软件进行作图，Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken试验设计。

2 结果与讨论

2.1 萌发时间对芸豆GABA含量和GAD活性的影响

萌发是高等植物生命活动最强烈的时期之一，该过程中种子营养成分首先被分解，为生长和合成提供能量，同时伴随不同途径进行新物质的合成。已有研究证实：萌发时间对藜麦、苦荞等植物富集GABA影响达到显著水平[13,20]，所以探究了不同时间所得萌发芸豆中GABA含量和GAD活性变化，结果如图1所示。

图1 萌发时间对芸豆GABA含量和GAD活性的影响Fig.1 Individual effect of incubation time on GABA content and GAD activity in germinated kidney bean

芸豆原料GABA含量为69.16 mg/100 g，在浸泡12 h后即萌发0 h时GABA质量分数达到109.48 mg/100 g。这是因为在芸豆逐渐吸水的过程中，酶作用下胚乳中的干物质转化为可溶性物质，从而为胚乳呼吸和发芽供给营养，奠定了GABA合成的物质基础[21]。萌发0～24 h过程中GABA含量逐渐增加，在24 h时达到一个峰值（143.44 mg/100 g）后又逐渐降低。GAD活性与GABA含量变化趋势相似，验证了王中磊等[15]的结论：芸豆GABA积累量与GAD活性呈正相关。当萌发时间为24 h时，GAD活性最高，为对照的9.26倍。GAD的活性在萌发处理过程中被激活，可促使芸豆中原有的谷氨酸脱羧生成GABA，从而使GABA含量升高。在24～36 h内GABA含量逐渐降低，原因可能是底物谷氨酸的含量逐渐降低或者丙酮酸转氨酶的活性大于GAD活性，丙酮酸转氨酶将生成的GABA又转化成琥珀酸半醛，导致GABA合成量低于GABA消耗量，从而使总含量降低[22]。

胚芽随着萌发时间增加而生长过长，在干燥后容易脱落，给后期加工带来困难。而且有报道表明，过长的发芽时间会造成营养成分有较大损失[23]。综合考虑不同萌发时间下芸豆的GABA含量和GAD活性测定结果，确定芸豆萌发以24 h为宜，后续试验在此基础上进行。

2.2 外源因子胁迫对萌发芸豆GABA含量的影响

2.2.1 MSG质量浓度对萌发芸豆GABA含量的影响

作为L-谷氨酸的衍生物，MSG溶解性更好，在水中解离后也可以被GAD利用，因此综合成本等角度选择MSG来富集GABA[24]。不同浓度MSG对萌发芸豆中GABA含量的影响如图2a所示。相比去离子水对照，外源MSG添加对GABA生成有显著促进作用（P＜0.05）。MSG质量浓度在2 g/L以下时，GABA含量与MSG质量浓度呈现相同的增长趋势，而当质量浓度达到2 g/L以后，GABA含量几乎不再增加，原因应为底物分子与酶分子的结合已达到饱和状态，随后底物质量浓度的增加造成培养液中离子质量浓度的增加，从而给细胞壁较大压力，堵塞营养物质的运输通道，使其进出细胞的活动受到限制，不利于GABA的合成与运送，所以继续增加底物的质量浓度不会导致GABA含量的增加[25,26]。MSG质量浓度在1～5 g/L时，GABA含量差异不显著（P＞0.05），最终选择MSG最佳添加量为1 g/L。

图2 外源因子胁迫对萌发芸豆GABA含量的影响Fig.2 Effects of exogenous factors stress on GABA content in germinated kidney bean

2.2.2 NaCl浓度对萌发芸豆GABA含量的影响

有报道[27,28]表明，NaCl胁迫对植物的萌发、生长发育和渗透调节的影响可能与植物的抗逆机制有关，植物在盐逆境下会促进GABA的产生。不同浓度NaCl对萌发芸豆中GABA的影响如图2b所示。相比去离子水对照，外源NaCl添加对GABA生成无显著促进作用（P＞0.05）；NaCl浓度在50～250 mmol/L时，GABA含量差异不显著（P＞0.05）。由此可见，采用不同浓度的NaCl培养液不能达到富集芸豆GABA的目的，验证了申迎宾等[29]在豇豆萌发工艺研究中得出的结论。

2.2.3 CaCl2对萌发芸豆GABA含量的影响

植物中的GAD区别于其他物种来源的主要特征在于它的碳末端部分存在一个钙调素（GAM）结合区域，Ca2+或CaM可激活多种植物的GAD表明GAD受Ca2+/CaM信号转导途径调节[30,31]。不同浓度CaCl2对萌发芸豆中GABA含量的影响如图2c所示。随着CaCl2浓度的增加，芸豆中GABA含量先升高后降低，CaCl2浓度为4 mmol/L时GABA含量有最高值为208.55 mg/100 g，比对照组（143.44 mg/100 g）提高了45.4%。究其原因，可能是当Ca2＋浓度低于4 mmol/L时，随着Ca2＋浓度的增加，细胞质中Ca2＋浓度增加，从而增强了激活GAD的能力，导致GABA的积累；但Ca2＋浓度继续增加会使细胞质中Ca2＋达到饱和，GAD活力不再增强，同时CaCl2溶液中Ca2＋浓度的升高使水解程度加剧，溶液pH值降低，进一步降低了细胞质pH值，使GAD无法被激活，萌发芸豆中GABA水平降低[32]。萌发芸豆培养液中适量添加CaCl2显著提高了GABA含量，证明了Ca2+对芸豆GAD的激活作用，由此可推测芸豆GAD也是一种钙调素结合蛋白，可以利用Ca2+对芸豆GAD的激活作用来提高GABA的产量。

2.2.4 AsA质量浓度对萌发芸豆GABA含量的影响

pH值是影响GAD活性的因素之一，GAD最适pH值为4.0～5.0，因此在发酵过程中需维持酸性环境[33]。不同质量浓度AsA对萌发芸豆中GABA的影响如图2d所示。GABA含量随着AsA浓度的增大先升高后趋于稳定。AsA质量浓度在0～1 g/L之间GABA含量有一定增加，AsA质量浓度在1.0～4.0 g/L时，萌发芸豆中GABA含量无显著性差异（P＞0.05），AsA质量浓度为1 g/L时，GABA积累的水平最高（215.05 mg/100 g），是去离子水对照组的1.50倍。加入适量酸形成的逆境胁迫可促进GABA积累，但是H+浓度过高可能会使芸豆种子pH值偏低，GAD等酶的活性受到抑制，从而抑制了GABA的生成。GABA生成和转化在芸豆发芽过程中是一系列可逆的反应，所述发芽培养液成分若用量过少，将无法达到实现转化GABA的最佳量，若使用量过多，又会抑制GABA的生成和积累。

2.2.5 PLP浓度对萌发芸豆GABA含量的影响

GAD是一种吡醛类裂解酶，由PLP与脱辅基蛋白构成，二者的解离和聚合可以极大影响GAD的活性[34]。不同浓度PLP对萌发芸豆中GABA含量的影响如图2e所示。PLP浓度在1.5 mmol/L时，GABA含量达到峰值为269.46 mg/100 g，表明PLP可刺激GAD的活性进而促进GABA积累，与Bai等[19]的结论相符。但在0.5～1.0和1.5～2.0 mmol/L之间，GABA含量随着PLP浓度的升高呈下降趋势，因为PLP浓度的增加也有利于增强GABA转氨酶的活性，但这取决于PLP浓度和转换的GABA的浓度[14]。综上所述，结合PLP成本较高的因素，不考虑将其作为富集GABA的条件。而维生素B6作为磷酸吡哆醛的前体，也可有效提高GABA含量。申迎宾等[35]发现用1.0 mmol/L维生素B6浸泡豇豆可使其GABA含量达到萌芽前的1.5倍左右。证实了维生素B6可有效提高GABA含量。邓宇等[36]在研究浸泡液对发芽糙米GABA富集的影响时，比较了不同浓度PLP和维生素B6的效果，发现二者具有可替代性。

2.3 Box-Behnken试验结果

为了进一步提高萌发芸豆中GABA含量，以MSG质量浓度（A）、CaCl2浓度（B）、AsA质量浓度（C）为自变量，以GABA质量分数为响应值，Box-Behnken试验优化芸豆萌发富集GABA工艺的结果见表2。采用包括5个中心点重复在内的17个组合，研究各因素对GABA含量的联合效应。通过二次逐步回归分析实验结果，得到各因素与GABA含量之间函数关系的回归方程；生成方差分析（ANOVA）以确定单个线性、二次和交互回归系数；通过F检验法检验多项式关系的显著性；通过对回归系数的统计分析生成回归模型的等高线图。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and test results

2.3.1 二次多项式回归模型的建立

通过对表2中数据进行二次多元逐步回归拟合，可以得到MSG质量浓度（A）、CaCl2浓度（B）和AsA质量浓度（C）与GABA含量之间的二次回归方程：

Y=-135.93100+187.18825A+80.93350B+84.96725C+6.20000AB-19.43250AC-.95750BC-43.24175A2-9.20231B2-16.27175C2

上述回归模型的方差分析（表3）显示P＜0.001即该模型极显著，失拟项在0.05水平上不显著（P＞0.05），说明建立的模型对本实验拟合程度良好，符合芸豆萌发过程中的GABA含量随萌发条件的变化规律。因此该模型可以用于预测萌发芸豆GABA变化情况。一次项A、B对响应值的影响较大，达到极显著水平（P＜0.001），而C影响则不显著（P＞0.05）；二次项A2、B2、C2达到显著水平；交互项AB、AC交互作用显著，BC交互作用不显著。

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance

2.3.2 Box-Behnken试验交互作用分析

对二次回归方程中对响应值有显著影响的任意两因素之间的交互作用进行分析后，得到三维响应面图。等高线是响应面在水平方向的投影，两因素交互作用显著则等高线呈椭圆形或马鞍形，反之等高线则为圆形[37]。由图3可以看出，各因素交互作用大小依次为：MSG与AsA＞MSG与CaCl2＞CaCl2与AsA，这与表3中回归分析结果相符。

图3 各因素交互作用对GABA含量影响的响应面图Fig.3 Response surface map of the interaction of various factors on GABA content

由图3a可知，响应面的坡度较陡峭，表示在AsA质量浓度为1 g/L条件下，MSG质量浓度和CaCl2浓度交互作用显著，在CaCl2浓度较低时，GABA含量随着MSG质量浓度的增加而增加，随着CaCl2浓度的升高，GABA含量增长幅度则减小甚至变成负数，说明在不同浓度CaCl2下，MSG质量浓度对GABA含量的影响也不同；图3b显示在CaCl2浓度为4 mmol/L条件下，AsA质量浓度和MSG质量浓度交互作用显著，在AsA质量浓度较低时，GABA含量随着MSG浓度的增加而增加，随着AsA质量浓度的升高，增加幅度逐渐减低；图3c显示在MSG质量浓度为2 g/L的条件下，CaCl2浓度和AsA质量浓度的交互作用不显著，说明AsA质量浓度对GABA含量产生的影响与CaCl2浓度无关。

2.3.3 回归模型的验证结果

根据Box-Behnken试验结果，芸豆富集GABA的最佳工艺为MSG质量浓度3.00 g/L、CaCl2浓度5.37 mmol/L、AsA质量浓度0.17 g/L，通过回归模型预测得到萌发芸豆GABA含量为306.04 mg/100 g，验证试验得出实际测定数值为303.60 mg/100 g，即在盐胁迫（3.00 g/L MSG、5.37 mmol/L CaCl2）协同0.17 g/L AsA处理下，萌发24 h的芸豆GABA积累量相比芸豆籽粒（69.16 mg/100 g）和去离子水萌发芸豆（143.44 mg/100 g）分别提高了338.98%和111.66%。预测值和实测值相近说明二者之间存在较高的拟合度，所建立的模型可以很好地预测芸豆萌发条件和GABA含量之间的关系。

3 结论

本研究在单因素实验基础上，运用Box-Behnken实验设计得出：四种外源因子MSG、CaCl2、AsA和PLP可激发芸豆富集GABA，当MSG质量浓度为2 g/L，AsA质量浓度为1 g/L，CaCl2为4 mmol/L，PLP为1.5 mmol/L时其激发作用最强，所得萌发芸豆中GABA的含量分别为芸豆籽粒的3.02、3.11、3.02和3.98倍；芸豆富集GABA的最优工艺为MSG质量浓度3.00 g/L、CaCl2浓度5.37 mmol/L、AsA质量浓度0.17 g/L，芸豆在该条件处理下萌发24 h可达到GABA含量为303.60 mg/100 g，分别为芸豆籽粒和去离子水处理萌发芸豆GABA含量的4.39和2.12倍。同时本研究表明：芸豆在盐协同抗坏血酸胁迫条件下GAD被激活，GABA大量积累，其中底物水平以及Ca2+和H+浓度的提高对该过程起重要作用。本研究为芸豆富集活性GABA组分及开发高GABA保健芸豆芽浆、芸豆芽粉等芸豆深加工产品提供了理论依据。