基于SmartChip HT-qPCR分析不同食品中抗生素抗性基因的多样性及丰度

陈亚波，谭贵良，胡燕玲，金倩仪，朱爽，孟嫚，邱雨薇，李雪雁

（1.中山市食品药品检验所，广东中山 528437）（2.电子科技大学中山学院，广东中山 528402）（3.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006）（4.广东利诚检测技术有限公司，广东中山 528436）

抗生素是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物或人工合成的类似物。抗生素对微生物的生长和代谢活动有较强的抑制作用，其在低浓度下就可在一定程度上抑制甚至杀死其他微生物[1]。据不完全统计，2020年我国农用抗生素产量达到23.14万t，预计2022年我国农用抗生素产量达23.86万t。然而抗生素的过量或长期低剂量的使用会使微生物产生耐药性[2]，导致抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）的产生和传播[3]。

ARGs被认定为21世纪新型污染物[4]，它广泛存在于人类、动物体内以及复杂的环境中。ARGs可通过各种可移动遗传元件（Mobile Genetic Elements，MGEs）如整合子、转座子或质粒等，通过水平基因转移（Horizontal Gene Transfer，HGT）的方式，转移到其它环境细菌和致病菌中[5]，对人类健康和生态环境造成潜在威胁。目前针对ARGs的大多数研究主要集中在土壤、饮用水、医院和生活污水等环境领域[6-8]，对于食品领域中ARGs的研究报道相对较少。在食品领域，已有的研究大都基于普通PCR或传统荧光定量PCR（q-PCR）检测食品中的ARGss。研究发现，在虾、鱼和贝类等水产品中可检出磺胺类、四环素类、氨基糖苷类ARGs（如tetA、tetB、tetM、sul Ⅱ、floR、aphA-1、aadA、ermB、cmlA）[9]；在发酵乳制品中可检出tetO、ermB、cat等22种常见ARGs[10]；在肉类、水产品、蔬菜和水果中可检出11个ARGs[11]；在畜禽养殖场周边蔬菜地生食蔬菜可检出磺胺类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、喹诺酮类4类ARGs[12]。最近，也有报道采用宏基因组测序方法研究了商品腐乳[13]、辣椒酱[14]以及牛奶和牛奶生产环境[15]中ARGs的分布和丰度。与前者不同，后者宏基因组测序方法属于高通量方法，不需要专门针对具体ARGs的种类设计引物，可检测出超过150种ARGs[15]。对更多的食品及环境中多种ARGs的检测分析，是当前以及今后一个重要的研究方向。

SmartChip定量PCR系统是美国WaferGen Biosystems公司推出的一款高密度、纳升级别的高通量实时定量PCR系统（High-Throughput qPCR，HT-qPCR）[16]。一张SmartChip包含5 184个微孔，一次运行可同时完成多达5 184个独立的扩增反应。该系统广泛应用于基因表达定量、基因分型等研究领域。特别是近年来SmartChip定量PCR系统在环境领域中ARGs的研究备受关注，研究涉及土壤[17]、猪粪施肥下的水稻和小麦叶片[16]，土壤及蔬菜[18]，最近也开始陆续应用于即食沙拉[19]、海鲈[20]等食品安全领域研究。但是对于采用HT-qPCR同时分析不同类型食品中ARGs的研究至今未见报道。

考虑到ARGs对人体健康的潜在风险，更全面的评估不同食品中的ARGs多样性及丰度显得尤为必要。因此，本研究针现有研究不足，采用SmartChip HT-qPCR方法，使用296对引物对水产品、发酵食品、肉类、蔬菜的285个ARGs和10个MGEs标记基因进行定量分析，旨在探究这些食品中ARGs和MGEs的分布特征，为潜在的食品安全风险分析提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验样品

分为水产品、发酵食品、肉类、蔬菜四大类，共15个样品。其中水产品样品2个（海鲈，AP-SB-2；草鱼，AP-WA-2）、发酵食品2个（黄豆酱，F-HDJ7；发酵火腿，F-HT1）、肉类3个（牛肉，M-BE-2；鸽子肉，M-DO-2；猪肉，M-PO-2）、蔬菜8个（大白菜，V-CA-3；香菜，V-CI-3；生菜，V-CL-2；生菜，V-CL-3；枸杞叶，V-CWL-3；莴苣，V-LE-2；番茄，V-TO-2；白萝卜，V-TU-2）。上述样品取自中山市的菜市场、海鲜市场和超市，于2 h内运送至实验室。

1.2 主要仪器与设备

SmartChip Real-time PCR系统，美国WaferGen Biosystems；Milli-Q Integral 3 System纯水系统，美国Millipore公司；高速冷冻离心机，德国Sigma公司；均质器，西班牙IUL公司，组织匀浆仪，美国MP公司；Qubit 2.0荧光计，美国Invitrogen公司。

1.3 样品前处理

处理样品前，将所有器具包括砧板、解剖刀、剪刀、镊子、研钵等进行灭菌处理；样品解剖过程带无菌乳胶手套。

（1）鱼样：取解冻后的鱼清洗表面，用解剖刀分离出肉及内脏。取约25 g肉或内脏放入带侧滤的一次性无菌均质袋中称重，加入10倍体积0.1%（m/V）蛋白胨水，放入拍打式均质器中拍打2 min～3 min；用无菌移液管吸出滤液，于-80 ℃保存以备下一步提取DNA。

（2）畜禽肉：取解冻后的样品，清洗表面，取约25 g肉或内脏放入带侧滤的一次性无菌均质袋中称重，加入10倍体积0.1%（m/V）蛋白胨水，放入拍打仪拍打2 min～3 min；用无菌移液管吸出滤液，于-80 ℃保存以备下一步提取DNA。

（3）蔬菜：方法1：用研钵研磨或用剪刀剪碎样品，取约25 g左右样品放入带侧滤的一次性无菌均质袋中称重，加入10倍体积0.1%（m/V）蛋白胨水。放入拍打仪拍打2 min～3 min；用无菌移液管吸出滤液，于-80 ℃保存以备下一步提取DNA。方法2：取蔬菜日常可食用部分，经无菌水清洗后，称量按叶菜类1:4、根茎类1:1的比例加入0.1%（m/V）蛋白胨水，浸泡30 min后超声5 min，将上清用0.22 µm滤膜抽滤，用无菌剪刀剪碎滤膜以备下一步提取DNA。

（4）发酵食品：直接取0.5 g样品，进行下一步DNA提取。

1.4 总DNA的提取

采用EZNA™ Mag-Bind Food DNA kit （Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA，美国）提取样品中的总DNA，每个样3个重复。DNA浓度和质量采用Qubit 2.0进行测定和评估，提取的DNA保存于-20 ℃，以备后续分析。

1.5 ARGs和MGEs的高通量测定

抗生素抗性基因检测使用SmartChip高通量荧光定量PCR系统完成，该系统每次能够并行5 184个纳升级qPCR反应。本次实验中共设置296对引物，其中285对抗性基因引物、10对可转移基因引物对（包括2对Ⅰ类整合酶基因、8对转座酶基因）、1对细菌通用16S rRNA基因内参引物。高通量荧光定量PCR扩增体系的体积为100 nL，其反应体系为：1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster、500 nmol/L each primer、DNA模板2 ng/μL。PCR反应混合液先使用纳升级多样品点样仪（MSND）的16（Samples）×296（Assays）模式加入到微孔芯片中，随后在cycler上进行qPCR反应，共运行3张芯片。PCR反应程序为：预变性95 ℃，10 min；接着95 ℃变性30 s、60 ℃退化30 s，共40个循环。使用仪器的qPCR软件对qPCR结果进行自动分析。检测阈值Ct=31，每个样品进行3次技术重复，至少2次技术重复都扩增出来则被认为目的基因在该样品中有检出。做相对定量时，作图数据采用Relative copy number=Copy(gene)/Copy(16S)，其中Copy(gene)和Copy(16S)均来自同一样品。其中，Copy=10(31-CT)/(10/3)。将Relative copy number×106，然后取以10为底的对数值，进行热图绘制。采用利用R package pheatmap（版本1.0.8）绘制聚类热图。

1.6 数据分析

采用Excel 2019进行数据整理，采用GraphPad Prism 8进行柱状图作图。

2 结果与讨论

2.1 ARGs和MGEs的多样性

在所有检测的样品中，共检测到9个大类的抗生素抗性基因（图1），分别是氨基糖苷类（Aminoglycoside）、β-内酰胺类（Beta-Lactamase）、氯霉素类（Chloramphenicol）、大环内酯-林可霉素-链阳霉素类（Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B，MLSB）、多重耐药类（Multidrug），磺胺类（Sulfonamide）、四环素类（Tetracycline）、万古霉素（Vancomycin）以及其他类。其中，样品F-HDJ7（黄豆酱）、V-CA-3（大白菜）、V-CI-3（香菜）、V-CL-3（生菜）和V-CWL-3（枸杞叶）检出的ARGs较多，分别检测出ARGs 161个、136个、165个、128个和182个。这些样品中检测到的ARGs数量与前人在即食沙拉样品到的大致相同（156个）[19]。上述15个样品共检出ARGs亚类（指具体的ARG）234个（氨基糖苷类33个，β-内酰胺类45个，氯霉素类3个，多重耐药类45个，MLSB 33个，磺胺类6个，四环素类36个，万古霉素类21个、其他类12个以及移动基因元件10个（IS613、Tp614、cIntI-1(class1)、intI-1(clinic)、tnpA-01、tnpA-02、tnpA-03、tnpA-04、tnpA-05、tnpA-07）（表1）。

表1 样品中的MGEs分布Table 1 The diversity of MGEs

图1 不同样品中ARGs的数量及多样性Fig.1 Numbers and diversity of ARGs detected in various samples

细菌可以通过可移动遗传元件（MGEs）如整合子、转座子、质粒的水平基因转移而获得ARGs[5]，从而使得该菌获得抗生素抗性。MGEs是部分ARGs的携带载体，在ARGs的水平转移中起着非常重要的作用，其转移不但可以发生在同一种属细菌甚至还发生在细菌和真菌之间[21]。对MGEs的分布研究发现（表1），所有样品均可检出整合酶和转座酶基因。具体而言，所有样均能检测整合子基因intI-1(clinic)；除了M-DO-2和V-CA-3外，其余样品均能检出转座酶基因tnpA-01和Tp614，所分析的8个转座酶基因均能在2个蔬菜样品（V-CI-3和V-CWL-3）被检出。intI-1属于Ⅰ类整合子，在前人对水产品[9]和零售食品[22]的研究中也均有发现。研究发现，超过80%的人体或畜禽体内的肠细菌（Enterobacteria）中存在该整合子[23]。整合子是一种重要的基因捕获和传播元件，能够通过整合酶从外界环境中捕获和堆积一个或多个ARGs，在微生物的耐药性中具有重要作用，是耐药基因水平传播的重要机制。在所有样品中均检测到Ⅰ类整合子，说明抗生素的使用增加了这类基因尤其intI-1（clinic）的丰度，这些MGEs介导的细菌耐药性传播而引起的食源性疾病应引起重视。

2.2 ARGs抵抗机制分析

ARGs抵抗机制见图2。检测到ARGs抵抗机制包括：抗生素灭活机制（Antibiotic Deactivate）、细胞保护机制（Cellular Protection）、外排泵机制（Efflux Pump）、Integrase、Transposase及其他机制。其中，抗生素灭活机制、外排泵机制和细胞保护机制为主要的ARGs抵抗机制，它们丰度占比最高，在样品中的平均数量分别为44个、34个和24个，即这些样品中ARGs抵抗机制贡献大小依次为：抗生素灭活机制＞外排泵机制＞细胞保护机制，该结果与前人的报道相同[19]。抗生素灭活机制、外排泵机制和细胞保护机制为目前已知的三种主要细菌耐药机制。外排泵在细菌中广泛存在，是引起细菌多重耐药的重要机制[24]。细菌细胞膜上的主动外排泵可将抗菌药物排至细菌外，从而阻碍抗菌药物与细菌内的靶点结合，从而引起耐药[25]。

图2 ARGs的抵抗机制分析Fig.2 Analysis of antibiotic resistance mechanism detected in ARGs

2.3 样品中ARGs的热图分析

本研究利用R package pheatmap绘制聚类热图，通过热图展现ARGs在不同样品中的丰度分布模式（图3）。图中颜色由绿色-黄色-红色，表示ARGs的丰度逐渐递增，白色表示样品未检出该抗生素抗性基因。从图3可以看出，三个样品即V-CWL-3（182个）、V-CI-3（165个）和F-HDJ7（161个）富集的ARGs数量最多。但是水产品（AP-SB-2、AP-WA-2）和肉类样品（M-DO-2、M-PO-2）中含有的ARGs丰度较高，其中海鲈（AP-SB-2）、鸽肉（M-DO-2）和猪肉（M-PO-2）富集多种ARGs，如氨基糖苷类（aac(6')-Ib(aka aacA4)-03、aadA5-01、strB）、磺胺类（folA、sul1）和四环素类（tetA-02、tetD-01），其中aac(6')-Ib(aka aacA4)-03在AP-SB-2样品中的相对丰度高达3.6 copies/16S rRNA gene。其他研究采用HT-qPCR对海鲈中的11个ARGs进行了分析，但只检测到8个ARGs：sul1、sul2、floR、tetQ、tetM-01、cmlA1-01、tetG-01和vanA[20]。本研究也在水产样品检测到上述7个ARGs（vanA除外）。本研究结果表明，水产品和肉类样品富集多种高丰度的ARGs，可能与这些水产和畜禽在养殖过程中大量使用抗生素有关。发酵食品及蔬菜中ARGs的丰度普遍较低，但发酵食品中也有个别ARG的丰度较高，如黄豆酱样品（F-HDJ7）中tetK，其相对丰度为0.07 copies/16S rRNA gene。

图3 聚类热图Fig.3 Heatmap of ARG subtypes in different samples

2.4 样品中共有及特有的ARGs

最后，本文还分析了水产品、发酵食品、肉类、蔬菜四类样品中共有及特有的ARGs，结果如图4所示。结果表明，四类样品中共有的ARGs达79个，其中四环素类达19个（tet(32)、tet(36)-01、tet(36)-02、tetA-02、tetB-02、tetD-01、tetD-02、tetG-01、tetL-01、tetL-02、tetM-01、tetM-02、tetO-01、tetPB-03、tetR-02、tetR-03、tetS、tetT、tetX）、氨基糖苷类15个（aac(6')-Ib(aka aacA4)-02、aac(6')-Ib(aka aacA4)-03、aacC2、aadA-01、aadA-02、aadA2-01、aadA2-02、aadA2-03、aadA5-01、aadA9-01、aadD、aadE、aph(2')-Id-02、aphA1(aka kanR)、strB）、多耐药性5个（floR、qac、qacEdelta1-01、qacEdelta1-02、rarD-02）、磺胺类3个（folA、sul1、sul1）、氯霉素类1个（cmlA1-01）。

图4 不同样品中ARGs的维恩图Fig.4 Venn diagram of the unique and overlapping of ARG subtypes among different sample types

特有的ARGs分析表明，总共发现有51个特有的ARGs（表2），其中蔬菜样品中特有的ARGs最多（36个），其次是发酵食品（13个）；含特有的ARG最少的是水产品和肉类，均只含有1个，分别是pmrA和bla-ACC-1。pmrA属于多重耐药类ARGs，而bla-ACC-1属于β-内酰胺类ARGs。蔬菜中特有的ARGs主要属于氨基糖苷类（Aac、aac(6')-Iy、aacC1、aacC4、aadA9-02、spcN-01、spcN-02）、β-内酰胺类类（ampC-04、ampC-07、blaCMY、blaCTX-M-02、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXY、blaPAO）和MLSB类（ceoA、ereA、ermJ/ermD、ermK-02、ermY、lnuC、mexA、mexD、oleC、pikR2、yceE/mdtG-02）；而发酵食品中特有的ARGs主要属于β-内酰胺类（blaCTX-M-01、ndm-1、Pbp）、四环素类（tetJ、tetPB-04、tetU-01）和万古霉素类（vanC1、vanTE、vanTG）（表2）。发酵食品和肉类含有较多固有的ARGs，推测可能与这些样品中含有某些高丰度的微生物物种有关。

表2 样品中特有的ARGs统计分析Table 2 The unique ARG subtypes in different types of samples

3 结论

本研究对四个不同类别食品（发酵食品、水产品、禽畜肉、蔬菜）中的285种ARGs及10种MGEs进行了分析。结果表明，这些样品中含有较多的ARGs，特别是部分蔬菜样品中的ARG甚至可达182个。15个被分析的样品中，共检出234个ARGs，其中79个为所有样品中共有的ARGs，51个为特有的ARGs；水产品和肉类样品富集多种ARGs。这15个样品中的ARGs耐药机制主要是抗生素灭活机制、外排泵机制和细胞保护机制。与普通荧光定量PCR相比，本研究采用的Smartchip超高通量荧光定量PCR方法能检出较多的ARGs，对于研究样品中的ARGs和MGEs多样性和丰度具有显著的优势。分析更多的样品以及对样品中微生物组成与ARGs和MGEs相关性研究，将是未来的一个研究方向。总之，本研究对于了解不同类别食品中ARGs的赋存情况以及为食品安全风险分析提供了数据支持。