不同产地百香果黄果主要功能成分含量及抗氧化活性比较

徐青，杨江，李安定

（贵州科学院生物研究所，贵州贵阳 550009）

百香果（Passiflora edulisSims.）系西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora）的草质藤本植物，易生于海拔180～1 900 m的热带和亚热带山谷丛林，原产地为巴西，在我国主要分布广东、广西、海南、福建、云南、台湾等地。根据其形状和质量，市售百香果可分为百香果黄果（Passiflora edulisF.flavicarpa）、百香果紫果（Passiflora edulisF.edulis）及黄果和紫果的杂交种。百香果为果浆型水果，其果浆为黄色，含有多种功能成分，不仅营养价值高，还具有多种药用功效，有“果汁之王”的美称，是典型的药食同源的高品质水果，在民间广泛用于治疗焦虑症、哮喘、支气管炎、尿路感染、糖尿病等，受到研究者们的广泛关注[1]。

目前，国内外有关百香果的研究主要集中在栽培技术、果汁营养成分分析、果肉矿物质、挥发性和香气成分分析、功能性成分提取等方面，而对不同产地百香果功能性成分评价及药理活性研究鲜有报道。研究表明：百香果的品质受土壤、气候等地域条件影响较为显著[2-7]。贵州地处中国西南腹地，土壤和农业气候条件多样，自2016年以来，贵州开始了百香果的规模化、商品化种植，目前已达到近20万亩，但百香果种植的优势品种与产地选择还未能得到合理统筹规划，可能会带来百香果种植泛滥的问题，影响百香果资源下游中高端产品的研究与开发。基于贵州百香果生长环境多样，品质参差不齐，缺乏基于功能成分的综合质量评价[8]。本研究以贵州5个栽培产地的百香果黄果为研究对象，对百香果黄果果汁的主要功能成分（Vc、总黄酮、总多酚、总多糖和总花青苷）的含量和体外抗氧化活性（DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的清除作用）进行研究，以期明确百香果黄果在不同产地的主要活性成分含量和抗氧化性能的差异，为百香果的种植及产品开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百香果黄果分别采自贵州省东南部的榕江县（RJ）、从江县（CJ），贵州省南部的罗甸县（LD）、平塘县（PT）、望谟县（WM），采摘时间均为同年9月上旬。品种均为芭乐黄金果，一年生植株、采用同一管理条件。5个产地的地理气候特征如表1。

表1 百香果黄果采集产地地理气候特征Table 1 Geographical and climatic characteristics of yellow passion fruit

化学试剂：L-抗坏血酸、没食子酸、芦丁对照品均购自上海麦克林公司，质量分数≥99%；甲醇为Fisher色谱纯；水为实验室自制蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME104/02分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Agilent1260高效液相色谱仪，德国安捷伦科技（中国）有限公司；UV-1760型紫外分光光度计，日本SHIMADZU公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

挑选无机械损伤、大小均匀且成熟度一致的百香果黄果鲜果，清洁晾干，除去果皮和果籽，对果肉进行均浆，离心，过滤得果汁，称重。每个平行10个百香果，果汁混合均匀后-20 ℃保存，备用。

1.3.2 功能成分测定

1.3.2.1 维生素C（Vc）含量测定

采用HPLC法，准确称取Vc对照品，加水制成0.013～0.21 mg/mL的系列质量浓度的对照品标准溶液。取适量果汁样品，稀释一定倍数后得到供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜。色谱条件：色谱柱为Agilent SB-C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.10%磷酸溶液（5:95），流速为1.00 mL/min，检测波长为242 nm，柱温为30 ℃，进样量为1.00 μL。记录Vc的色谱峰面积，以Vc色谱峰面积为纵坐标，对Vc浓度作图，绘制Vc标准曲线，得到线性回归方程：Y=2 157.784 33X-7.401 38，R2=0.999 44。根据标准曲线计算百香果果汁中Vc的含量，结果表示为：（mg VcE/100 g）（VcE：Vitamin C equivalent，维生素C当量）[9]。

1.3.2.2 总黄酮的含量测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法，准确称取芦丁对照品，加水制成0.032～0.51 mg/mL的系列浓度对照品标准溶液。准确吸取芦丁对照品溶液及百香果果汁稀释样品6 mL，置于25 mL容量瓶中，加质量分数为5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加质量分数为10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加质量分数为4%氢氧化钠溶液10 mL，用水稀释至刻度，放置20 min，于499 nm波长下测定吸光度。以吸光度为横坐标，芦丁含量为纵坐标绘制黄酮标准曲线，得到线性回归方程：Y=1.474 9X+0.000 9，R2=0.999 8。根据标准曲线及样品吸光度，计算百香果果汁中总黄酮含量，结果表示为：（mg RE/100 g）（RE：Rutin Equivalent，芦丁当量）[9]。

1.3.2.3 总多酚的含量测定

采用福林-酚比色法，准确称取没食子酸对照品，加水制成0.006 3～0.20 mg/mL的系列浓度的对照品标准溶液。准确吸取没食子酸对照品溶液及百香果果汁稀释样品0.50 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入稀释10倍（体积比）的福林酚试剂2.50 mL，反应5 min，加质量分数为10% Na2CO3溶液2 mL，加水定容，混匀，室温避光反应60 min，于760 nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，没食子酸含量为纵坐标绘制多酚标准曲线，得到线性回归方程：Y=6.095 1X+0.014 2，R2=0.999 8。根据标准曲线及样品吸光度，计算百香果果汁中总多酚含量，结果表示为：（mg GAE/100 g）（GAE：Gallicacide Equivalent，没食子酸当量）[10]。

1.3.2.4 总多糖的含量测定

采用苯酚-硫酸法，准确称取葡萄糖对照品，加水制成0.010～0.080 mg/mL的系列浓度的对照品标准溶液。准确吸取葡萄糖对照品溶液及百香果果汁稀释样品1 mL，分别依次加入质量分数为6%的苯酚溶液1 mL和浓硫酸5 mL，静置10 min，混匀，放置20 min后，测定490 nm波长下的吸光度。以吸光度为横坐标，多糖含量为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，得到线性回归方程：Y=9.624 4X+0.052 6，R2=0.999 1。根据标准曲线及样品吸光度，计算百香果果汁中总多糖含量，结果表示为：（mg GE/g）（GE：Glucose Equivalent，葡萄糖当量）[11]。

1.3.2.5 总花青苷的含量测定

采用pH示差法，取果汁样品2 mL加pH值1.00 KCl缓冲液或pH值4.50的醋酸钠缓冲液稀释定容到10 mL容量瓶中，分别以520 nm和700 nm为吸收波长测定其吸光度，以矢车菊-3-葡萄糖苷表示总花青苷含量[12]。

式中：

TA——总花青苷含量（mg CyGE/100 g），表示100 g百香果果汁中花青苷总含量，（CyGE：Cy-3-Gluequivalent，矢车菊-3-葡萄糖苷当量）；

A1.0——pH值1.0时花青苷的吸光度；

A4.5——pH值4.5时花青苷的吸光度；

V——提取液的总体积，mL；

N——稀释倍数；

MW——矢车菊-3-葡萄糖苷（Cy-3-Glu）相对分子量（449.2）；

ε——Cy-3-Glu的消光系数（26 900）；

L——比色皿光路长，cm；

m——样品质量，g。

1.3.3 抗氧化性能研究性能测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

取0.10 mmol/L DPPH·-无水乙醇溶液，用无水乙醇做参比，扫波（200～700 nm），得到最大吸收波长；用无水乙醇稀释至Aλmax=1.20～1.30之间；将2 mL测试样品溶液及2 mL DPPH·溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下黑暗处静置30 min后，以水为参比，测定其最大吸收波长处吸光度As；同样方法，测定空白对照的吸光度A0，样品本底吸光度As0；以0.50 mg/mL抗坏血酸作为阳性对照。利用下式（2）计算DPPH自由基清除率K（%）[11]。

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

As——样品组最大吸收波长处吸光度；

A0——空白对照的吸光度；

As0——样品本底吸光度。

1.3.3.2 羟基自由基清除能力的测定

在比色管中依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水杨酸溶液、1 mL样液，充分混匀后，加入1 mL 8.80 mmol/L H2O2启动反应，于37 ℃下反应0.50 h，取上清液在510 nm处测得吸光值As；同样方法，测定空白对照的吸光度A0，样品本底吸光度As0；以0.50 mg/mL抗坏血酸作为阳性对照。按上式（2）计算羟基自由基的清除率K（%）[10]。

1.3.3.3 ABTS·清除能力的测定

首先，将7 mmol/L的ABTS+·的溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液按1:1体积混合，4 ℃避光12 h后得蓝绿色ABTS+·溶液，以水为参比，用蒸馏水稀释至波长734 nm下吸光值为0.70±0.020，得到7 mmol/L ABTS+·应用液。之后，取4 mL ABTS+·应用液，加入1 mL样液，混匀后，室温避光反应10 min，以水为参比，于734 nm波长处测定吸光度值As；同样方法，测定空白对照的吸光度A0，样品本底吸光度As0；以1.00 mg/mL抗坏血酸作为阳性对照。按上式（2）计算ABTS+自由基的清除率K（%）[9]。

1.4 数据处理

采用外标法，建立标准曲线，计算各指标的含量。每个实验进行三个平行试验，每个平行试验进行三个重复。试验数据采用SPSS 19.0统计软件分析，数据结果以均值±标准方差的方式表示，采用ANOVA进行邓肯式多重差异分析，以P＜0.05为显著差异，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同产地百香果黄果主要功能成分含量测定结果与分析

2.1.1 Vc含量

Vc是一种必需的水溶性微量营养素，也是一种抗氧化剂。按照1.3.2.1的方法测得Vc对照品溶液及其标准曲线如图1。

图1 Vc标准品图谱及其标准曲线Fig.1 Spectrum of Vc standard and its standard curve

本研究共采集贵州5个产地百香果样品5份，以相同方式处理，检测发现，其色谱图有一定的相似度，但色谱峰的强度有明显差异，以各产地Vc的出峰面积为参量，利用Vc标准曲线测得不同产地百香果Vc含量如图2所示。表明不同产地相同品种百香果Vc含量存在显著差异，其中，黔东南从江（CJ）的百香果黄果果汁中Vc含量最高为192.79 mg/100 g，其次是黔南望谟（WM）为156.18 mg/100 g，而最低为罗甸（LD）果汁中Vc含量为74.85 mg/100 g。根据Ramful等[13]提出的分类标准，Vc含量大于50 mg/100 g为具有高Vc含量，而本文中Vc含量最低的罗甸（LD）样品也要高于此标准，说明贵州这5个地区产的百香果黄果具有高Vc含量。文献报道，巴西卡里里地区的野生百香果（Passiflora glandulosaCav.）果肉中Vc最高含量为57.76 mg/100 g[14]，广东省农业科学院果树研究所百香果种植基地种植的芭乐黄金果果汁中Vc的含量最高为25.40 mg/100 g[4]。可见文献报道的Vc含量均小于贵州产的百香果果汁Vc含量（74.85～192.79 mg/100 g）。研究表明，Vc含量受气候因素和植物种类的影响很大。相比生长在黑暗中的植物，生长在光照下的植物的Vc含量会增加。例如RGB LED灯照明的甘蓝芽Vc含量最高[15]，紫外线照射可以使蚕豆芽的Vc含量增加78.3%等[16]。除了和光照有关，Vc含量还可能与气温、降雨量等有关。如表1所示，黔东南从江属中亚热带温暖类型气候，靠近赤道，年均温度适中，年降雨量较低，这种气候、地理环境使得种植在该地的百香果具有高的Vc含量。

图2 贵州不同产地百香果黄果果汁中Vc含量Fig.2 Vc content in yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou

2.1.2 总黄酮含量

黄酮类化合物广泛存在于各种植物中，具有丰富的生物活性。成熟果实中黄酮类化合物的最终浓度取决于黄酮类化合物合成、膜转运和降解或利用的平衡[17]。对贵州5个产地的5份百香果果汁总黄酮进行了测定。

由图3可知，不同产地百香果黄果总黄酮含量具有一定差异（P＜0.05），含量由高到低依次是榕江（RJ）＞从江（CJ）＞罗甸（LD）＞平塘（PT）＞望谟（WM）。可以看出黔东南地区从江（CJ）、榕江（RJ）产的百香果总黄酮含量（49.30～51.85 mg/100 g）要高于黔南地区罗甸（LD）、平塘（PT）、望谟（WM）产的百香果总黄酮含量（16.06～22.97 mg/100 g）。研究表明，植物中的黄酮含量受环境影响很大。例如Su等[18]研究发现低温对叶片总黄酮的积累有显著的积极影响，Sun等[19]报道大豆种子中的黄酮类化合物与降水量呈负相关，与日照时数呈正相关，Nascimento等[20]发现UV-B辐射可提高落地生根（Kalanchoe pinnata）叶提取物的总黄酮含量，而不影响提取物的抗氧化活性或产率。本研究结果（图3）与这些研究一致，即较低的温度、较少的降水、更多的日照时间和更多的UV-B辐射将增加总黄酮含量。

图3 贵州不同产地百香果黄果果汁中总黄酮含量Fig.3 Contents of total flavonoids in yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou

2.1.3 总多酚含量

对贵州5个产地的5份百香果果汁总多酚进行测定，如图4所示，不同产地百香果黄果总多酚含量存在一定差异（P＜0.05），其中，黔东南从江县（CJ）的百香果黄果中总多酚含量最高为86.92 mg/100 g，其次是其邻县榕江县（RJ）的为83.38 mg/100 g，接下来是黔南地区依次为望谟县（WM）、平塘县（PT）、罗甸县（LD）。说明黔东南地区产的百香果总多酚含量约85.15 mg/100 g总体高于黔南地区的（61.32～81.33 mg/100 g）。

图4 贵州不同产地百香果黄果果汁中总多酚含量Fig.4 Contents of total polyphenols in yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou

酚类化合物具有抗氧化性能，能够清除活性氧中间体而不引发进一步的氧化反应，对人体健康有益。然而，每种植物的酚类化合物含量会受多种因素的影响，如季节、气候条件、物种等。研究发现，这些因素可以在植物中以不同的方式表达，例如，在不同气候条件下采集的同一植物中，观察到酚含量存在差异[21]；在来自不同物种的同一植物中，观察到酚含量存在差异[22]。本研究的5个产地百香果黄果果汁中多酚的含量在61.32～86.92 mg/100 g范围内（图4），比来自巴西卡里里地区的野生百香果（Passiflora glandulosaCav.）的多酚含量（20.55 mg/100 g果肉）高两倍以上[13]。5个产地百香果果汁中多酚的含量总体变化趋势与黄酮含量变化趋势一致，即黔东南地区产的百香果多酚含量约85.15 mg/100 g总体高于黔南地区的，但也存在一定的差异。对比图3和图4，可知黄酮和多酚在百香果果汁里的积累受环境影响的因素还不完全一样。例如，黔南地区的望谟比罗甸的年均温度稍低、年降雨量更少、年日照更长、紫外线更强（表1），望谟百香果的多酚含量比罗甸的高1.3倍。

2.1.4 总多糖含量

百香果的香味浓郁，不同品种的百香果甜味存在明显差异，决定一个品种甜味和风味的主要因素是它的含糖量。利用苯酚-硫酸反应，测定了百香果中总多糖的含量在68.69～144.80 mg/g范围内（图5）。

图5 贵州不同产地百香果黄果果汁中总多糖含量Fig.5 Polysaccharide content in yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou

由图5可知，贵州不同产地百香果黄果果汁中总多糖含量总体较高，各地具有明显差异（P＜0.05），其中，黔南罗甸县（LD）的百香果黄果果汁中总多糖含量最高为144.80 mg/g，其次是黔东南从江县（CJ）的为126.16 mg/g，而黔东南榕江县（RJ）的百香果黄果果汁中总多糖含量最低为68.69 mg/g。Khan等[23]研究了不同甘蔗基因型的土壤养分和相关的根际细菌群落与糖含量的关系，结果表明，植物的糖含量受许多因素的影响，如土壤类型、植物营养状况、气候因素和植物种类。本研究结果应该是这些因素综合影响的结果。对于土壤养分，Wu等[24]应用水肥耦合措施，以氮肥剂量292 kg/hm2，钾肥 146.55 kg/hm2和P2O5肥439.5 kg/hm2，水1 778.4 m3/hm2，可以获得甘蔗的最大糖产量。

2.1.5 总花青苷含量

采用pH示差法测得贵州5个产地百香果果汁中总花青苷的含量如图6所示，说明贵州不同产地百香果黄果果汁中总花青苷含量总体相对较低，各地具有明显差异（P＜0.05），其中，黔东南从江县（CJ）的黄果果汁中总花青苷含量最高为1.23 mg/100 g，其次是黔东南榕江县（RJ）的为1.09 mg/100 g，而黔南罗甸县（LD）、望谟县（WM）、平塘县（PT）百香果果汁中总花青苷含量均较低。说明黔东南地区产的百香果花青苷含量（1.09～1.23 mg/100 g）要显著高于黔南地区的（0.12～0.31 mg/100 g）。这与上面总黄酮、总多酚含量趋势相同。

图6 贵州不同产地百香果黄果果汁中总花青苷含量Fig.6 Contents of total anthocyanins in yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou

花青苷广泛存在于植物的花、果实、茎及叶中，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、改善糖尿病及保护心血管等功效[25]。研究表明，果实中花青苷的积累不仅受遗传、品种、部位等因素的影响，还受环境因素的影响。例如，Shi等[26]研究得出，与百香果黄果果皮相比，百香果紫果果皮中的总花青苷含量丰富，在成熟后期可以达到1.00 mg/g。Mereles等[27]报道，在巴拉圭生长的香蕉瓜（Sicana odorifera）果皮和果肉中的花青苷分别为19.70和2.64 mg/g。大量研究表明，花青苷的生物合成与温度呈负相关[28,29]。本研究的5个地区百香果果汁中总花青苷的含量（图6）存在显著差异（P＜0.05），与温度、降雨量、日照时间、紫外线强度呈负相关，应该是这些因素共同作用的结果，还有待进一步研究。

2.2 不同产地百香果黄果抗氧化性能测定结果与分析

2.2.1 对DPPH自由基的清除作用

按照1.3.3.1的方法测得百香果黄果果汁对DPPH自由基清除率如图7所示。

图7 贵州不同产地百香果黄果果汁对DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou on DPPH free radicals

由图7可以看出，不同产地百香果黄果果汁对DPPH自由基的清除作用相差不大，除了黔南平塘县（PT）百香果果汁对DPPH自由基的清除率为89.01%之外，其它产地的清除率在94.78%～97.03%之间，与0.50 mg/mL Vc清除DPPH自由基的能力（95.89%）相当。由2.1测得的不同产地百香果主要功能成分含量结果可知，相比其它产地，平塘县百香果果汁中的功能成分含量低，导致其DPPH自由基的清除率低。

2.2.2 对羟基自由基的清除作用

按照1.3.3.2的方法测得百香果黄果果汁对羟基自由基清除率如图8所示。

图8 贵州不同产地百香果黄果果汁对羟基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou on OH free radicals

由图8可见，不同产地百香果黄果果汁清除羟基自由基的能力相差不大，在96.30%～99.31%之间，与0.50 mg/mL Vc清除羟基自由基的能力（99.66%）接近。

2.2.3 对ABTS+自由基的清除作用

按照1.3.3.3的方法测得百香果黄果果汁对ABTS自由基清除率如图9所示。

图9 贵州不同产地百香果黄果果汁对ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of yellow passion fruit juice from different habitats in Guizhou on ABTS+ free radicals

由图9可以看出，5个产地百香果黄果果汁对ABTS+自由基的清除能力相差不大，在89.14%～95.59%之间，与1.00 mg/mL Vc清除ABTS+自由基的能力（96.45%）相当。

2.3 不同产地百香果黄果果汁功能成分与抗氧化活性相关性分析

采用SPSS 19.0软件对百香果果汁在设计的3个抗氧化模型（DPPH·清除、·OH清除、ABTS+·清除）上表现出的抗氧化能力与5个功能成分（Vc、黄酮、多酚、多糖、花青苷）含量进行了相关性分析，结果如表2所示。

表2 百香果黄果果汁功能成分与抗氧化活性相关性分析Table 2 Correlation analysis of functional components and antioxidant activity of yellow passion fruit juice

由表2可知，DPPH自由基清除效果与Vc含量、总黄酮含量和总花青苷含量相关性较大，而与总多酚含量和总多糖含量相关性较小。Lima-Neto等[14]发现，巴西卡里里地区的野生西番莲果肉清除DPPH自由基的效率较低，且与多酚含量呈显著负相关性（r=-0.74；P＜0.01）。OH自由基清除效果与Vc含量、总黄酮含量、总多酚含量和总花青苷含量相关性较大，而与总多糖含量呈负相关。ABTS自由基清除效果与总多糖含量相关性较大，而与其它功能成分呈负相关。

3 结论

通过对贵州不同栽培产地百香果黄果果汁中5种功能成分含量的测定分析，发现不同产地百香果黄果功能成分含量存在较大的差异。黔东南从江县（CJ）产的百香果黄果果汁中Vc、总多酚和总花青苷含量最高，黔东南榕江县（RJ）产的百香果黄果果汁中总黄酮含量最高，黔南罗甸县（LD）产的百香果黄果果汁中总多糖含量最高。总体来说，黔东南地区（CJ、RJ）产的百香果果汁中总多酚、总黄酮、总花青苷含量比黔南地区（LD、PT、WM）的高，这可能与产地的气候、年均气温、年降雨量、年日照情况、紫外线强度等有关，此外，可能还与土壤类型、植物营养状况等有关，有待进一步分析研究。

不同产地同一品种的百香果黄果果汁具有不同的抗氧化活性，对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基都表现出强的清除能力，各产地差异不大。不同产地同一品种的百香果黄果果汁对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力具有相同的趋势，即黔东南地区（CJ、RJ）产的百香果黄果果汁对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力比黔南地区（LD、PT、WM）的高，这可能与黔东南地区产的百香果黄果果汁中含有更高的功能成分（多酚、黄酮、花青苷）有关。相关性分析得出，百香果果汁的自由基清除性能不是本实验所测的某一种功能成分起作用，而是这些功能成分共同作用的结果。关于百香果黄果果汁中的其他功能成分还有待进一步分析研究。

近年来，百香果因其功能成分丰富而深受消费者喜爱，百香果产业在贵州也发展较快。本文首次对贵州百香果黄果主要功能成分及抗氧化活性进行报道，可为优良品种的选择及大健康产品的开发、产业化应用提供参考，后续还将根据产业发展需求进一步深入研究。