直肠癌患者治疗前后循环肿瘤DNA、癌胚抗原、糖类抗原199水平变化及其相关性

蔡丽彬, 胡 蒙

(江苏省人民医院溧阳分院/江苏省溧阳市人民医院, 1. 放射治疗科, 2. 肿瘤内科, 江苏 溧阳, 213300)

直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率呈逐年增高趋势,仅次于胃癌和食管癌[1-3]。CRC早期临床症状不明显, 20%以上的患者在首次发现时已发生远处转移[4]。因此,早发现、早预防已经成为CRC治疗的关键[5-6]。目前, CRC患者首选治疗方式是手术,但多数患者确诊时已为晚期,术后存活率较低。卡培他滨具有较强靶向性[7], 给药后能迅速被肠黏膜吸收,高效抑制肿瘤细胞的蛋白质和RNA合成,进而更好地杀灭肿瘤细胞,降低远处转移率及局部复发率,改善患者预后。CRC的诊断依赖于多种炎症因子和肿瘤标志物,其浓度变化对病情的发展、术后预后具有较高的辅助判断价值。本研究采用放疗联合卡培他滨化疗治疗CRC患者,观察其循环肿瘤DNA(ctDNA)、血清癌胚抗原 (CEA)及糖类抗原199(CA199)水平变化,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2021年1月—2022年9月江苏省溧阳市人民医院肿瘤科收治的经病理检查确诊为CRC的患者38例为研究对象。38例CRC患者病理分期为Ⅱ期17例,Ⅲ～Ⅳ期21例; 男24例,女14例; 年龄40～82岁。本研究获得医院医学伦理委员会批准,所有患者及家属均签署书面知情同意书。

纳入标准: ① 经病理学检查确诊为CRC者; ② 均无其他恶性病变者; ③ 自愿入组,积极配合治疗及随访者。排除标准: ① 结肠炎、直肠炎及新冠肺炎等病史者; ② 严重感染性疾病患者; ③ 无法完成随访者。

1.2 方法

给予38例CRC患者放疗(使用ELEKTA infinity直线加速器, PHILIPS大孔径模拟CT机购自Royal Philips of the Netherlands)联合口服卡培他滨片治疗(商品名: 卓仑; 生产厂家: 齐鲁制药有限公司; 国药准字: H20133361; 批号: 1E0783DE3、1D0703DE3、1D0523DE3、1C0413DE3), 每日2.5 g/m2, 连续治疗5周。

血液标本采集: 分别收集38例CRC患者治疗前和治疗1、2、3、4、5周的外周静脉血5 mL, 做好标记。采集2 h内, 4 ℃ 3 000×g离心10 min, 提取上清液,对其上清液中细胞碎片进行清除,具体为上清液4 ℃ 16 000×g离心10 min, 所得上清液分装在1.5 mL EP管中,检测相关指标,其余血清液氮冻存,以备检测。

1.3 实验室指标检测

ctDNA的定量: 严格照按QIAamp Circulating DNA Kit说明书提取血清中ctDNA, 取ctDNA 2 μL作为聚合酶链反应(PCR)定量模板,以LINE1为靶基因,进行扩增。反应条件为: 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性 5 s, 60 ℃ 退火20 s, 72 ℃延伸 20 s, 循环45次。实验重复3次。

CRC患者血清CEA、CA199的测定: 采用全自动电化学发光免疫测定仪(美国罗氏公司ModularE170)检测血清CEA、CA199, 具体步骤按照仪器说明书严格操作。所需试剂均购自罗氏公司。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0软件对实验数据进行分析,首先行正态性检验,不符合正态分布的数据采用[M(P25,P75)]表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRC患者临床资料与治疗前ctDNA水平的相关性分析

38例CRC患者ctDNA含量为810(650, 1 005) ng/mL。治疗前, CRC患者血浆ctDNA含量与其病理分期、性别、年龄无相关性(P>0.05), 见表1。

表1 CRC患者临床资料与治疗前ctDNA的相关性分析[M(P25, P75)]

2.2 CRC患者临床资料与治疗前CEA、CA199水平的相关性分析

38例CRC患者CEA、CA199含量分别为4.30(4.00, 4.90)、16.75(14.00, 18.63) U/mL。CRC患者治疗前肿瘤标志物CEA水平与患者病理分期、性别、年龄无相关性(P>0.05)。CA199水平与患者性别、年龄无相关性(P>0.05); CA199水平与肿瘤的病理分期具有相关性(P<0.05), 见表2。

表2 CRC患者临床资料与治疗前CEA、CA199水平的相关性分析[M(P25, P75)] U/mL

2.3 CRC患者治疗前后ctDNA、CEA及CA199水平变化

治疗后CRC患者血清中ctDNA、CEA、CA199水平低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05), 见图1。

A: 治疗前后ctDNA水平; B: 治疗前后CEA水平; C: 治疗前后CA199水平。图1 CRC患者治疗前后ctDNA、CEA以及CA199水平变化

2.4 CRC患者治疗后ctDNA、CEA、CA199水平变化趋势

ctDNA含量在治疗开始时明显增加, 1周后逐渐下降,放疗4周后含量趋于稳定; CEA、CA199含量一直下降,在放疗3周后趋于稳定,见图2。

A: ctDNA水平变化趋势; B: CEA水平变化趋势; C: CA199水平变化趋势。图2 CRC患者治疗前后ctDNA、CEA、CA199水平变化趋势

2.5 治疗前CRC患者ctDNA、CEA及CA199含量的相关性

治疗前, CRC患者的ctDNA含量与CEA含量无相关性(r=0.005,P=0.323); CRC患者治疗前ctDNA含量与CA199水平呈正相关(r=0.365,P=0.021), 见图3。

A: 治疗前CRC患者ctDNA含量与CEA含量相关性散点图; B: 治疗前CRC患者ctDNA含量与CA199含量相关性散点图。图3 治疗前CRC患者ctDNA含量与CEA、CA199含量的相关性

2.6 治疗后CRC患者ctDNA含量与CEA、CA199含量的相关性

治疗5周, CRC患者ctDNA含量与CEA含量无相关性(r=-0.013,P=0.354); CRC患者ctDNA含量与CA199水平呈正相关(r=0.318,P=0.013), 见图4。

A: 治疗后CRC患者ctDNA含量与CEA含量相关性散点图; B: 治疗后CRC患者ctDNA含量与CA199含量相关性散点图。图4 治疗后CRC患者ctDNA含量与CEA、CA199含量的相关性

3 讨 论

CRC发病率呈上升趋势和年轻化趋势[8-10]。大多数CRC患者早期症状不明显,易出现漏诊,且部分患者术后依从性差,导致病情复发或转移,严重威胁其生命健康。对CRC进行早期诊断是提高治疗效果的关键因素[11]。随着分子技术发展,寻找特异度及灵敏度高的CRC相关分子探针,有利于快速诊断CRC[12]。

癌症患者的ctDNA主要来自于癌细胞,与健康者相比,恶性肿瘤患者血浆ctDNA水平明显增高, ctDNA含量和其特殊性质的改变能够反映出原发性肿瘤的特点[13-16]。此外, ctDNA检测具有多种优点,可随时监测,准确、快速地反映肿瘤基因突变,对肿瘤患者早期诊断具有重要意义[17]。研究[18]显示, ctDNA水平变化可以较好预测转移性CRC的预后。在接受三线放疗的转移性CRC患者血浆中, ctDNA水平与总生存具有相关性[19-20]。此外, ctDNA水平可以反映各种生理、病理过程,其对患者肿瘤特异性基因突变具有良好的预测价值[21]。癌细胞的基因突变为动态变化的,非相对稳定状态, ctDNA具有实时反映癌细胞基因变异状态的优势[22-23]; 研究[24-25]发现, ctDNA具有肿瘤原发灶、肿瘤侵袭灶和转移灶的全部遗传信息,且不会受肿瘤异质性的影响。

CEA浓度与CRC密切相关, CRC患者中CEA显著增加。CA199是一种常见的肿瘤标志物,其水平变化与多种消化道肿瘤相关。研究[26]发现, CEA、CA199浓度变化与肿瘤进展密切相关。本研究旨在追踪治疗后CRC患者血清 CEA、CA199水平以及ctDNA水平变化,以评价ctDNA作为CRC放疗效果及预后判断的生物学指标的可行性。本研究发现,患者在接受治疗1周后,血清中ctDNA含量较治疗前出现一过性增加,这可能是由于肿瘤组织在放化疗过程中受到刺激,导致肿瘤组织释放出更多的ctDNA。此后,患者ctDNA水平开始下降并逐渐趋于平稳,这与放化疗后肿瘤组织开始缩小,产生ctDNA的来源减少, ctDNA进一步减少释放,并逐渐降低趋于平稳。患者接受治疗后, CA199、CEA水平持续下降,在治疗3周后, CA199、CEA含量降至正常水平,其原因或与肿瘤组织缩小或消失有关,以及血清中CA199、CEA逐渐降解导致。

本研究结果显示,治疗前CRC患者ctDNA、CEA水平与年龄、性别、病理分期不存在相关性; 与CRC Ⅱ期患者相比, Ⅲ～Ⅳ期患者CA199浓度显著上升,证明CA199水平与该疾病的病理分期具有相关性,患者CA199浓度越高其分期越晚。本研究发现, CRC患者治疗前血浆中ctDNA和CEA浓度间无相关性(r=0.005,P=0.323); ctDNA含量与CA199水平呈正相关(r=0.365,P=0.021), 证明CEA和CA199含量的变化对CRC患者诊断、疗效和预后评价具有重要意义。放疗5周, CRC患者ctDNA含量与CEA含量间无相关性(r=-0.013,P=0.354); ctDNA含量与CA199水平呈正相关(r=0.318,P=0.013)。上述结果提示, ctDNA、CA199水平变化对临床疗效的判断更具有参考价值。

综上所述, ctDNA在CRC中具有良好的诊断价值,同时其与肿瘤标志物CA199关系密切,可能可用于联合评估CRC患者预后效果,但该结论还需进一步证实。