玉米大斑病菌遗传多样性的分子标记研究进展

赵霖熙，崔林开，韩赞平*

（1.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023；2.河南科技大学园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023）

玉米大斑病是生产中一种常见的全球性真菌病害，由大斑刚毛座腔菌〔Setosphaeriaturcica（Luttr.）K. J. Leonard & Suggs〕 〔无性态Exserohilumturcica（Pass）Leonard & Suggs〕引起，1876 年在意大利首次发现，之后在世界各地流行至今[1，2]。1899 年玉米大斑病首次在我国东北地区被发现[3]，之后在我国常年发生流行至今，对玉米产量和质量造成严重影响，一般导致玉米减产10%～20%，发病重时玉米减产幅度高达50%以上[4，5]。

玉米大斑病在玉米整个生育期均可以发病，拔节期和抽穗期是发病高峰期。玉米大斑病主要为害玉米叶片，也可侵染叶鞘和苞叶，发病初期形成黄绿色水渍状斑点，最终形成灰褐色或中间浅褐色、边缘暗褐色的梭形病斑，发病严重时造成整株枯死[6]。当田间相对湿度达到90%时，病斑表面会产生灰黑色霉层。玉米大斑病菌生理分化现象明显，玉米大斑病菌的生理小种分布在我国十分复杂，目前已经报道的生理小种有0、1、2、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、12N、13N、123、23N 和123N 共16 种[7]，优势小种为1 号小种[8]。

随着生物学技术的飞速发展，遗传多样性研究不仅局限于形态标记、细胞标记以及生理生化标记等传统的研究方法[9]，分子标记技术因其直接以DNA 的形式表现不受环境和其他因素的影响而广泛应用到遗传多样性的研究中[10]。生物遗传多样性研究需要合适的标记来反映群体的遗传特征。研究玉米大斑病菌遗传多样性，对揭示其遗传变异、病害防治以及抗病品种选育具有重要意义。对近年来不同分子标记技术在国内外玉米大斑病菌遗传多样性方面的研究进展进行综述，并对研究中的问题及今后的研究方向进行了分析，以期为玉米大斑病菌的研究提供理论依据。

1 玉米大斑病菌遗传多样性研究的DNA 分子标记及其利用

1.1 随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）

RAPD 是由美国科学家Williams 和Welsh 于1990年发展起来，建立在以PCR 为基础的一种新型的DNA分子标记技术[11，12]。其具有操作简单、检测迅速、灵敏度高、所需DNA 量少等优点，但是，RAPD 为显性标记，扩增结果易受外界因素影响，试验重复性较差。

RAPD 技术已经广泛应用于遗传图谱的构建、品种鉴定及亲缘关系分析等[13]，在真菌的遗传多样性及亲缘关系研究中应用非常广泛。张明会等[14]利用RAPD分子标记技术研究了39 株玉米大斑病菌的遗传多样性，结果表明，玉米大斑病菌具有丰富的种内遗传多样性，在遗传相似系数为0.76 时可以将39 株玉米大斑病菌划分为6 组，分组的划分与病原菌的地理来源无直接关系。姜开梅等[15]研究表明，云南省玉米大斑病菌存在丰富的遗传多样性，RAPD 分子标记技术能够揭示病原菌间的遗传差异及亲缘关系。Abadi 等[16]利用RAPD 分子标记技术分析了玉米大斑病菌不同生理小种、不同地理来源玉米大斑病菌的遗传多样性，结果表明，0、1 和N 号生理小种与23 号生理小种的遗传变异很大，来自非洲的菌株遗传多样性较来自以色列的高。Ferguson 等[17]通过21 对RAPD 引物研究了来自美国的251 株玉米大斑病菌的遗传多样性，发现各个州内遗传变异较大，并指出群体遗传结构变异很可能是有性生殖和无性生殖的结果。Dong 等[18]利用RAPD 标记对我国北方地区的玉米大斑病进行了遗传多样性分析，结果表明，玉米大斑病菌群体具有较高的遗传多样性，同时玉米大斑病菌群体可能发生了遗传迁移。

1.2 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）

AFLP 是1992 年荷兰科学家Zebeau 发明的一种新DNA 分子标记技术[19]。AFLP 结合了RFLP 和RAPD的优点[20，21]，表现为多态性高、所需DNA 量少、敏捷高效、重复性好，但是操作方法比较复杂。由于其优点突出，因而AFLP 技术广泛应用于遗传多样性的研究。

孙淑琴[22]利用AFLP 分子标记研究了32 个玉米大斑病菌的有性杂交F2代的遗传变异，从256 对引物中共筛选出89 对能够有效扩增的引物，表明玉米大斑病菌F2代存在丰富的遗传多样性，证明有性杂交能够导致玉米大斑病菌发生遗传变异。王玉萍[23]通过26 对AFLP 引物研究了90 株玉米大斑病菌的遗传多样性，其中11 对引物能扩增出多态性相对丰富的DNA 条带，聚类分析结果表明玉米大斑病菌群体内遗传变异相对比较丰富，其遗传变异与菌株地理来源无明显的相关性，90 个菌株两两之间的相似系数为0.246 4～1.00。赵辉[24]利用AFLP 指纹图谱的研究结果表明玉米大斑病菌群体具有明显的遗传多样性，聚类分析结果表明玉米大斑病菌的群体遗传多样性与地理位置无关。

1.3 简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）

SSR 也叫微卫星DNA（microsatellite DNA），于1991 年由Moore 等[25]创立。SSR 标记因在不同个体的碱基重复次数及重复单元不同能够表现高度的特异性，因而是目前较为流行的分子标记技术之一[26]。SSR 标记具有在基因组中分布广泛、多态性高、呈共显性、结果稳定、易于检测等诸多优点，广泛应用于遗传多样性研究、基因定位以及遗传图谱构建等[27，28]。

Hassbrook 等[29]成功开发了13 对玉米大斑病菌SSR引物，并通过南非6 个省的共26 株玉米大斑病菌进行了SSR 验证，结果表明，13 对SSR 引物均具有多态性。Human 等[30]利用SSR 分子标记技术研究了南非3 块玉米田共258 株玉米大斑病菌，结果发现，玉米大斑病菌遗传多样性较低，遗传结构相对单一，该研究发现各采样地点的菌株之间有多个相同的单倍型，表明分生孢子可以发生长距离迁移或可以直接通过人类介导的移动进行移动。Li 等[31]利用SSR 分子标记技术对黑龙江省的60 株玉米大斑病菌进行了遗传多样性分析，结果显示，黑龙江省的玉米大斑病菌遗传多样性相对比较丰富，分子方差分析表明群体遗传多样性与交配型具有明显的相关性，而与菌株的地理位置相关性不大。高鹏飞[32]通过6 对SSR 引物对48 株玉米大斑病菌进行遗传多样性分析，结果表明，河南省玉米大斑病菌具有丰富的遗传多样性，聚类分析在相似系数为0.66 时可以将河南省8 个群体共48 株玉米大斑病菌划分为2 个类群，并且玉米大斑病菌的遗传分化与病原菌的地理学来源无明显的相关性。Human 等[30]利用SSR 分子标记技术对玉米大斑病遗传多样性的研究结果与其他学者有所差异，主要原因可能是其研究中采样相对集中，导致玉米大斑病遗传多样性相对较低。SSR 分子标记技术具有诸多优点，因此成为目前玉米大斑病遗传多样性研究的主流方法。

1.4 简单序列重复区间（inter-simple sequence repeats，ISSR）

ISSR 是Zietkiewicz 等[33]于1994 年提出的一种新型分子标记技术。ISSR 分子标记操作简单、快捷，同时结合了SSR、RAPD 以及AFLP 等分子标记的优点，在遗传多样性、指纹图谱构建、遗传作图、基因定位等研究中被广泛应用[34]。

谷守芹等[35]对ISSR-PCR 反应体系进行优化，从40 对ISSR 引物中筛选出9 对多态性丰富的ISSR 引物，对44 株玉米大斑病菌进行遗传多样性分析后发现多态性条带占40.3%，表明玉米大斑病具有较为丰富的遗传多样性，聚类分析结果显示在阈值为0.8 时可以将病原菌划分为7 个类群。郭丽婕[36]利用ISSR分子标记技术对2011～2014 年中国玉米产区的玉米大斑病菌进行遗传多样性分析，发现多态性比例最低为77.8%，表明中国玉米大斑病菌具有丰富的遗传多样性；通过聚类分析发现，玉米大斑病菌的遗传多样性与地理来源有一定关系；比较分析不同年份玉米大斑病菌群体遗传结构发现，相同地理位置的玉米大斑病菌群体遗传结构变化显著。Dai 等[37]以福建省7 个甜玉米主要生产区的117 株玉米大斑病菌为材料，利用ISSR 分子标记技术进行玉米大斑病菌遗传多样性、群体遗传结构以及交配型分布的分析，发现福建省玉米大斑病菌遗传多样性相对比较丰富，群体遗传分化水平与交配型比例具有相关性。目前，ISSR 分子标记已经成熟应用于玉米大斑病菌遗传多样性的研究。

1.5 相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）

SRAP 又名基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP），是Li 和Quiros[38]提出的一种新型的分子标记技术。其原理是利用基因外显子里G 和C 含量丰富，而启动子和内含子里A 和T含量丰富的特点设计2 套引物，对开放阅读框架进行扩增。SRAP 分子标记具有多态性高、重复性好、操作简单、引物具有通用性等特点，被应用于遗传多样性分析、遗传图谱的构建、比较基因组学等研究。马周杰等[39]利用SRAP 标记对东北地区57 株玉米大斑病菌进行遗传多样性分析，平均多态性比率达68.75%，表明东北地区玉米大斑病菌菌株间具有丰富的遗传多样性；聚类分析结果表明，病原菌的遗传相似系数为0.76～1.00，当遗传相似系数为0.76 时可以将病原菌划分为2 个类群，同时病原菌的群体遗传分化与病原菌的地理学来源相关性不大，与病原菌的交配型有密切的相关性。

1.6 单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）

SNP 是继SSR 和ISSR 分子标记之后的新一代分子标记[40]。近年来，SNP 分子标记在各个领域的应用得到了飞速发展。由于SNP 分子标记具有遗传稳定性高、SNP 位点丰富、富有代表性、检测迅速并且易于实现自动化分析等特点，SNP 分子标记在Bin 图谱构建、高通量SNP 芯片分型以及群体遗传进化研究中应用得越来越广泛[41]。目前，SNP 分子标记研究遗传多样性在动植物中应用较为广泛；在病原菌中应用较少，在大豆灰斑病和黄萎病的病原菌遗传多样性研究中有采用SNP 分子标记的相关报道[42，43]，但其在玉米大斑病菌遗传多样性领域的相关研究尚未见报道。因此，SNP 技术在真菌遗传多样性领域的研究还有待发展。

2 展望

随着分子生物学的发展和遗传多样性研究技术的不断完善，分子标记技术以高效、简便、精确度高等特点逐渐取代传统的研究方法，可以预见，今后一段时间内基于DNA 分子水平和组学研究仍是玉米大斑病菌群体遗传多样性研究的主要方法，并将越来越精细。但是，目前并没有一种完美的分子标记技术，各种分子标记技术都有一定的局限性。RAPD 技术的稳定性和多态性水平较差，试验结果易受环境条件和人为因素的影响，不同的条件下，结果差异较大，试验可重复性较低[44]；AFLP 技术虽然多态性水平高，但是由于操作相对复杂，试验成本较高，同时其对反应条件及DNA 的浓度要求较高，限制了该技术的推广应用；ISSR 技术需要摸索PCR 的最适反应条件，同时由于该方法不能区分显性纯合基因型与杂合基因型，使其在应用中受到了一定的限制；SRAP 技术在应用中由于分子标记定位的随机性，需要的样本量较大[45]。目前，SSR 分子标记技术由于其诸多优点，已经成为遗传多样性研究中的主流分子标记技术；SNP 虽然是新一代的分子标记技术，但是该技术在遗传多样性方面的研究相对较少，相关研究方法还有待开发。

农业生产中，玉米大斑病的主要防治措施是选育和种植抗病品种，研究玉米大斑病菌群体遗传结构对于抗病品种的选育以及玉米大斑病的防治及预报预测具有重要意义。对比玉米大斑病菌群体遗传多样性的相关研究可以发现，不同地区玉米大斑病菌的群体遗传结构有所差异，但总体上玉米大斑病菌具有相对丰富的遗传多样性。说明玉米大斑病菌遗传结构差异较大。不同学者利用不同的分子标记技术研究表明，玉米大斑病菌遗传多样性与病原菌地理来源相关性不大，表明玉米大斑病菌能够进行远距离传播，也表明该病在我国发生严重。目前，分子标记技术能够很好地揭示玉米大斑病菌的群体遗传结构，并能说明其与地理来源、病原菌交配型等因素的关系，但是未能解释群体遗传结构发生变异的主要原因以及群体遗传变异与玉米大斑病菌致病性之间的关系。我国玉米大斑病菌具有丰富的遗传多样性，但是关于玉米大斑病菌遗传多样性的进化机制研究较少，其遗传进化机制尚未明确。玉米大斑病的生理小种在我国分布极其广泛，目前关于玉米大斑病菌不同生理小种遗传多样性的研究相对较少，不同生理小种玉米大斑病菌的遗传多样性是否发生分化还有待研究。

关于玉米大斑病遗传多样性方面的研究，今后工作重点应放在以下几个方面：（1）玉米大斑病菌遗传多样性及其致病性之间的关系；（2）玉米大斑病菌的进化机制；（3）不同生理小种的玉米大斑病菌之间的群体遗传结构是否具有明显的分化现象。