甲基转移酶SETDB1和SOX7甲基化在口腔癌中的相关性研究

郝妍 白相宇 霍峰 陈喜波

口腔癌是我国常见恶性肿瘤,发病率逐年递增,其具有侵袭性,预后较差的特点,5年生存率仅45%左右[1,2]。基因序列改变是造成癌症的发生发展的重要因素,但基因的表观遗传变化在肿瘤中也发挥着关键性作用[3]。研究发现,口腔癌中某些关键抑癌基因的甲基化修饰可影响基因表达,进而调控口腔癌的生物学功能,最终影响患者的预后[4,5]。SOX7在口腔鳞癌中可以发生甲基化修饰,且具有一定特异性,但其作为分子诊断的敏感度相对较低[6]。因此,探讨口腔癌SOX7基因甲基化修饰上游分子至关重要。SETDBl是组蛋白甲基化转移酶家族中重要一员,参与多种基因的甲基化修饰,并与多种肿瘤密切相关[7,8]。SETDBl可催化基因的甲基化,但其作为甲基化转移酶对SOX7的甲基化修饰作用尚不明确。本研究中通过检测口腔癌中SOX7基因的甲基化水平、SETDBl的表达,分析SETDBl表达与SOX7基因甲基化的相关性,探讨口腔癌的发病机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本与细胞 取口腔外科手术治疗的口腔鳞癌患者癌组织及癌旁组织各52例。纳入研究的患者均无其他肿瘤病史,手术前均无任何治疗史。52例患者中,男39例,女13例;≥60岁35例,<60岁17例;TNM分期:I期17例,Ⅱ期22例,Ⅲ期13例;高分化11例,中分化32例,低分化9例;有淋巴结转移12例,无淋巴结转移40例。口腔癌KB细胞购自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 甲基化试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司;DNA提取试剂购于深圳市益百顺科技有限公司;SETDBl单克隆抗体购于中国Abeam公司;免疫组化SP试剂盒和浓缩型DAB试剂均购自广州威佳科技有限公司;RNA引物由南京聚雄华生物科技有限公司设计合成。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸测序:对癌组织和癌旁组织提取DNA并进行亚硫酸盐转化,将DNA扩增产物进行焦磷酸测序,PyroQ-CpG软件分析位点甲基化状态,计算甲基化率。甲基化引物序列:F,5’-GTTTTGGACGTCGAGTTGTC-3’R,5’-AACCCAAACCATAAAAACGTT-3’。PCR反应条件:95℃,预变性10 min,1个循环;94℃,变性,45 s,退火45 s,72℃,延伸45 s,共35个循环;72℃再延伸10 min。

1.3.2 免疫组织化学法:组织切片脱蜡,高温修复抗原。山羊血清封闭,加入一抗过夜(SETDB1抗体,1∶1 000;SOX7抗体,1∶1 000)。次日二抗孵育,DBA显色,苏木素复染。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR):提取RNA,应用RNA反转录试剂盒反转录。荧光定量试剂盒检测目的基因mRNA。

1.3.4 细胞培养及转染:细胞常规培养口腔癌KB细胞,以转染siRNA SETDBl细胞为实验组(si-SET),转染无siRNA细胞为阴性对照组(si-N),正常细胞为空白对照组(NC)。细胞悬液计数,接种到6孔板。用30 μl 1×riboFECT CP Buffer(V1)稀释1.25 μl 20 μmol/L siRNA储存液(V2),轻轻混匀,室温孵育;加入3 μl riboFECT CP Reagent(V3),混匀孵育;将riboFECT CP混合液加入到465.75 μl细胞培养基(V4)中,使总体积达到500 μl,混匀;继续培养48 h后以荧光倒置显微镜观察转染效果。

1.3.5 Western Blot:提取总蛋白,测定浓度,制备电泳蛋白上样液,行凝胶电泳。电泳后,转膜。加一抗4℃过夜。次日孵育二抗,重复洗膜后显影。

2 结果

2.1 口腔癌和癌旁组织中SOX7甲基化水平 口腔癌组织和癌旁组织中,SOX7基因甲基化率分别为(62.34±2.14)%和(11.41±1.87)%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 口腔癌和癌旁组织中SOX7甲基化率 %,

2.2 口腔癌和癌旁组织中SOX7和SETDB1mRNA相对表达量 口腔癌组织中SOX7 mRNA相对表达量为低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织中SETDB1 mRNA相对表达量高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 口腔癌和癌旁组织中SOX7和SETDB1 mRNA相对表达量

2.3 口腔癌和癌旁组织中SOX7和SETDB1蛋白表达量 癌组织SOX7蛋白阳性表达率低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织SETDB1蛋白阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2,表3。

图1 口腔癌和癌旁组织中SOX7和SETDB1蛋白表达(HE ×200);CT 癌组织,PT 癌旁组织

图2 口腔癌和癌旁组织中SETDB1和SOX7蛋白表达量(Western Blot);CT 癌组织;PT 癌旁组织

表3 口腔癌和癌旁组织中SOX7和SETDB1蛋白表达量 %,

2.4 口腔癌组织中SOX7甲基化和SETDB1的相关性 SOX7甲基化和SETDB1表达,呈正相关(r=0.324,P<0.05)。见表4。

表4 癌组织中SOX7甲基化与SETDB1表达的相关性 例

2.5 口腔癌组织中SOX7甲基化及SETDB1与临床病理特征的相关性 SOX7甲基化与口腔癌TNM分期、组织分化及淋巴结转移相关(P<0.05),与性别和年龄无关(P>0.05)。SETDB1阳性表达与TNM分期、分化程度及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。见表5。

表5 口腔癌组织中SOX7甲基化、SETDB1与临床病例特点的关系

2.6 RNA干扰下调SETDB1后KB细胞中SETDB1和SOX7的表达 Rt-qPCR和Wesrern Blot结果显示,si-SET、si-N和NC组中,以si-SET组SETDB1 mRNA和蛋白表达最低,而si-N和NC组SETDB1 mRNA和蛋白表达无差异。SETDB1 si-RNA干扰在KB细胞中成功。si-SET组SOX7 mRNA和蛋白表达最高,明显高于si-N和NC组,而si-N和NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3～5,表6,7。

明视野 荧光显微镜 明视野与荧光显微镜的叠加

图4 RNA干扰SETDB1转染KB细胞后SETDB1蛋白表达量;Si-SET SETDB1 si-RNA组,Si-N 阴性对照组,NC 空白对照组

图5 RRNA干扰SETDB1转染KB细胞后SOX7蛋白表达量;Si-SET SETDB1 si-RNA组;Si-N 阴性对照组;NC 空白对照组

表6 RNA干扰SETDB1转染KB细胞后SETDB1 mRNA相对表达量 %,

表7 RNA干扰SETDB1转染KB细胞后SOX7 mRNA相对表达量

2.7 Si-RNA干扰 SETDB1对口腔癌KB细胞SOX7甲基化的影响 焦磷酸测序检测结果显示,si-SET组SOX7甲基化水平最低(P<0.05),而si-N和NC组差异无统计学意义(P>0.05),提示抑制甲基转移酶SETDB1的表达可以明显降低KB细胞中SOX7甲基化水平。见表8。

表8 干扰SETDB1后3组细胞内SOX7甲基化率 %,

3 讨论

口腔癌是是全世界范围内高发癌症,也是我国一种常见的头颈部恶性肿瘤,其发病率和死亡率逐年增加,严重影响人民群众的生命健康[9,10]。针对口腔癌的综合治疗使得患者整体生存期有所提高,但预后仍然较差[11]。因此,从基因分子水平探究口腔癌发病机制,为口腔癌的早期诊断和治疗提供新的靶点成为本领域研究的首要任务。

现代分子生物学研究显示,表观遗传学重点甲基化修饰几乎存在于所有的肿瘤细胞内,该变化参与多种肿瘤的发生发展[12]。人体细胞内基因异常的甲基化修饰使多种肿瘤基因的转录、翻译和表达异常,最终导致肿瘤的发生发展、转移、恶化[13,14]。SOX7是编码转录因子SOX基因家族中的重要一员,参与多种生命体活动。SOX7在多种恶性肿瘤中呈现低表达状态,与前列腺癌和膀胱癌的增殖、侵袭和转移相关[15,16]。进一步研究表明,SOX7基因在肝癌和肺癌中呈高甲基化状态,且甲基化与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关[17,18]。

本研究通过检测口腔癌组织中SOX7甲基化进行分析,结果表明SOX7基因在口腔癌组织中发生了甲基化,且其甲基化率明显高于癌旁组织。口腔癌组织中SOX7的高甲基化状态与肿瘤的TNM分期、分化以及淋巴结的转移具有相关性;结果说明SOX7基因的高甲基化可能与口腔癌的增殖、侵袭和转移密切相关。进一步检测SOX7的表达水平发现,癌组织中SOX7 mRNA和蛋白的表达水平显著下降,提示SOX7可能因其发生甲基化而抑制了基因的转录和蛋白的表达。笔者推测,SOX7可能在口腔癌组织中扮演了“抑癌因子”的角色,其高甲基化状态使其基因表达抑制或缺失,进而促进了口腔癌的进展。

甲基转移酶的参与癌基因的甲基化修饰,且其动态变化对肿瘤的发生和发展起了至关重要的作用[19]。有学者研究发现,多种甲基转移酶家族中蛋白质在肿瘤中呈现高表达,与肿瘤关系密切[20,21]。研究显示,甲基转移酶的异常表达与其甲基化异常有关,参与了多种肿瘤的增殖、侵袭和转移[22,23]。

SETDB1是一种重要的甲基化转移酶,参与多种肿瘤的发生[24]。本研究结果显示,口腔癌组织中SETDB1 mRNA和蛋白的表达均显著明显升高,且其阳性表达与口腔癌的分期、癌分化和淋巴结转移相关。随着肿瘤分期的增加、肿瘤分化的降低,SETDB1表达量上升;且SETDB1在有淋巴结转移者中的表达明显高于无淋巴结转移组织。这提示SETDB1可能增强了口腔癌细胞的增殖侵袭能力,进而使口腔癌的恶性程度增强。

研究证实,联合降低多种甲基化转移酶可使肿瘤细胞的整体基因甲基化率明显下降,并促进多种癌症的发生[25]。目前国内外研究中,SETDB1作为一种甲基化酶是否参与SOX7甲基化的修饰尚未见相关研究。本研究统计分析结果显示,口腔癌组织中SOX7高甲基化与SETDB1的阳性表达具有相关性,二者呈正相关。提示SETDB1作为甲基化转移酶参与了SOX7基因的甲基化,可能促进了口腔癌的增殖、侵袭和转移,SETDB1可能是促进SOX7基因发生甲基化的一个重要上游分子。体外实验结果显示,SETDB1表达下调后SOX7基因发生了去甲基化,且SOX7 mRNA和蛋白表达均显著上升。这提示抑制甲基化转移酶SETDB1的表达可以降低SOX7基因甲基化率,促进SOX7的表达,进而发挥其促癌作用。同时也说明,在口腔癌中SETDB1可以作为甲基化转移酶催化SOX7发生甲基化修饰。

综上所述,在口腔癌中甲基化转移酶SETDB1与SOX7甲基化修饰密切相关,SETDB1的高表达促进了SOX7高甲基化状态,二者可能是促进口腔癌发生发展的重要分子学生物事件。