鸦胆子苦醇对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的疗效及其机制研究

陈茜 韩晓凤 唐雪勇 龚娟 胡祥宇

摘要：  目的  探究鴉胆子苦醇对balb/c小鼠银屑病模型的疗效及对相关炎症因子的影响。 方法  将6-8周龄雌性balb/c小鼠随机分为：正常对照组、模型组、卡泊三醇组、鸦胆子苦醇高、中、低剂量组， n =6。小鼠背部剃毛，连续7天62.5mg IMQ涂抹造模，同上各组小鼠分别给予对应干预治疗。记录形态学变化并行PASI评分，干预结束后行常规HE染色，实时荧光定量PCR法检测组织NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、IL-17的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹法检测NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α等相关蛋白表达水平。ELISA检测血清 细胞因子IL-1β、IL-17、IL-6表达水平。 结果  鸦胆子苦醇治疗后，小鼠银屑病样皮损明显减轻，高中低剂量组PASI评分较模型组均有明显好转（ P <0.05），HE结果显示鸦胆子苦醇治疗组角质层增厚情况较模型组明显减轻，且表皮平整，表皮突恢复平整，炎症细胞浸润减轻。Real-time PCR、 Western blot 及ELISA结果经治疗后相关因子均明显表达下调（ P <0.001）。 结论  鸦胆子苦醇有效减轻了银屑病小鼠皮损症状，这种改善作用可能通过NF-KB及相关炎症因子信号通路调控。

关键词：  银屑病；鸦胆子苦醇；NF-κB信号通路

中图分类号 ：R758.63    文献标志码 ：A    文章编号 ：1007-2349（2023）08-0076-06

Study o the Effect and Mechanism of Brusatol on Psoriatic Lesions Induced by IMQ in Mice

CHEN Qian， HAN Xiao-Feng， TANG Xue-Yong， GONG Juan， HU Xiang-Yu

（Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine/Chongqing First People's Hospital， Chongqing 400011， China）

【Abstract】 Objective： To study the effect of brusatol on balb/c mouse psoriasis model and related inflammatory factors. Methods： Female balb/c mice aged 6-8 weeks were randomly divided into normal control group， model group， calcipotriol group， and brusatol groups of high-dose， medium-dose and low-dose （ n =6）. The back of mice was shaved， 62.5mg IMQ was applied for seven consecutive days， and corresponding intervention treatment was given to the mice in the same groups as above. Morphological changes and PASI score were recorded， and routine HE staining was performed after the intervention. The mRNA expression levels of NF-κB， CK1， CK10， TNF-α， IL-1β and IL-17 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expression levels of NF-κB， pNF-κB， CK10， TNF-α and other related proteins were detected by Western Blot. The expression levels of serum cytokines IL-1β， IL-17 and IL-6 were detected by ELISA. Results： The psoriatic skin lesions of the mice were significantly alleviated after treatment with brusatol， and PASI scores of the high， medium and low dose groups were significantly improved compared with the model group （ P <0.05）. HE results showed that cholebrachitol treatment group was significantly alleviated compared with the model group. The epidermis was smooth， the epidermal process was restored and the inflammatory cell infiltration was alleviated. Results： The results of Real-time PCR， Western Blot and ELISA after treatment， the expression of related factors were significantly down-regulated （ P <0.001）. Conclusion： Brusatol can effectively reduce the symptoms of psoriasis in mice， and this improvement may be regulated by NF-KB and related inflammatory factor signaling pathways.

【Key words】 Psoriasis; Brusatol; NF-κB Signaling Pathway

银屑病（psoriasis）是一种多基因遗传性的慢性、复发性、炎症性皮肤病  ［1］。根据 World Psoriasis Day constortium 的报道，银屑病在全世界范围内的发病率为 3%。我国 2007 年 11 月-2008 年 9 月对中国六省市银屑病流行病学调查得出本病的患病率为 0.59%  ［2］。由于银屑病病因不明，缺乏特效药物，多年来研究人员一直致力于病因、发病机理与新药的探索，但仍然未取得根本性突破，包括生物治疗。如果从中医药的理论出发，辨证施治，挖掘新的治疗药物，将有可能提供一种全新的治疗手段。 鸦胆子（fructus bruceae）作为中医外科治疗“寒凉箍围药”的经典代表药，是苦木科植物鸦胆子（brucea javancia L.Merr.）属的干燥成熟果实。其性苦，味寒，有毒，有清热、燥湿、杀虫、解毒作用，可治疗痢疾、肿瘤、久泻、疟疾、痔疮、疔毒，外用可治赘疣、鸡眼  ［3-4］，文献报道鸦胆子苦醇在抗癌方面有一定疗效  ［5］。相关研究证明鸦胆子苦醇是一个在体外抗胰腺癌效果比喜树碱更强的化合物  ［6］。，鸦胆子的作用机制主要为抑制细胞有丝分裂，使细胞有丝分裂 停止在G1期，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。鸦胆子苦醇理论上也存在诱导细 胞凋亡，抑制细胞增殖的作用。目前普遍认为银屑病中表皮角质形成细胞与免疫细胞之间的失调导致表皮增生，而NF-kB可能是其中的一个环节，银屑病斑块的表皮表现出高水平的磷酸化p65，与表皮增生的级别密切相关。因此，本研究通过建立银屑病小鼠模型，初步探索鸦胆子苦醇通过调控NF-kB信号通路及相关细胞因子对银屑病小鼠模型干预机制。

1 材料

1.1 实验动物 雌性balb/c小鼠36只，6-8周龄，25 g-30 g，由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供（许可证号：SCXK-（渝）2017-0006）。

1.2 试剂与仪器 鸦胆子苦醇购买于江莱生物，咪喹莫特（IMQ）购买于四川明欣药业有限责任公司，DMSO、电泳相关基础试剂及β-actin抗体均购买于碧云天生物技术有限公司，ECL化學发光试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM、RT-PCR逆转录试剂盒购买于瑞士罗氏公司，NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α等一抗购买于abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗购买于联科生物公司，ELISA试剂盒购买于北京四正柏生物科技有限公司，所有引物均由擎科生物科技有限公司合成。蛋白电泳仪及酶标仪购买于BIO-RED，荧光定量PCR仪购买于瑞士罗氏公司。

2 实验方法

2.1 银屑病小鼠模型建立 Balb/c 小鼠提前1 d使用脱毛膏将背部2 cm×3 cm区域脱毛。次日，除正常组外，其余各组小鼠背部皮肤涂抹 5% 咪喹莫特乳膏 62.5 mg，正常组小鼠背部涂抹等量凡士林，每天 1次，持续7 d。

2.2 分组与给药 Balb/c 小鼠随机分为6组，每组 6只：正常对照组、模型组、卡泊三醇组、鸦胆子苦醇高浓度组、鸦胆子苦醇中浓度组、鸦胆子苦醇低浓度组。造模当天上午涂抹咪喹莫特后，下午进行涂抹卡泊三醇或尾静脉注射高中低剂量鸦胆子苦醇。鸦胆子苦醇溶于DMSO至浓度分别为20、50、100 nmol/L。

2.3 形态学观察及PASI评分 每日造模前，观察并记录各组小鼠皮损情况，同时采用银屑病面积和严重性指数评分法（psoriasis area and severity index，PASI）评估皮损严重程度。分别从红斑、鳞屑及皮肤增厚三个方面进行评分，无症状0分至极重度4分，各计0-4分，三个计分的总分为最终PASI评分。

2.4 组织病理切片HE染色 各组小鼠于第七天干预结束后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，取材，备用。皮损组织经多聚甲醛液固定、30%蔗糖溶液脱水、石蜡包埋、切片（厚6um）、行Hematoxylin-Eosin染色，光学显微镜拍照。

2.5 Real-time PCR 组织总RNA获取采用常规TRIZOL法，并进一步用ROCHE试剂盒逆转录成 cDNA。Real-time PCR的反应体系为：SYBR TaqII （2×）5 uL，上游引物0.5 uL，下游引物0.5 uL，cDNA  1 uL，dH 2O 3 uL，总体积为10 uL。 Real-time PCR程序为：95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30 s，总循环数为40；溶解曲线95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 1 s，冷却40℃  10 s。下表1为引物上下游碱基序列。

2.6 Western blot 组织总蛋白提取及制备，电泳分离（电压先80V分离0.5 h后，再调至120V分离约1.5 h），蛋白膜转移（电压100 V转移时间1 h），脱脂牛奶封闭1 h后加入合适稀释度的一抗（NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α），4℃冰箱孵育过夜，加TBST，于摇床洗膜3次每次10 min，合适浓度的二抗1 h，重复TBST洗膜3次每次10min，显色。ImageJ软件测量目的蛋白条带灰度值。

2.7 ELISA检测 小鼠眼眶取血后，离心分离小鼠血清，按照ELISA试剂盒说明对各组小鼠血清 IL-1β、IL-17、IL-6 细胞因子水平进行检测。

2.8 统计学分析 采用SPSS l 9.0统计软件对数据进行统计学分析，运用多个样本均数比较的方差分析检验，数据以表示，组间差异采用单因素方差分析。  P <0.05表示具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠银屑病模型建立及疗效 由下图1可见，与对照组比较，随着咪喹莫特持续涂抹，小鼠背部区域逐步出现红斑，鳞屑，皮肤持续增厚，至第7日，模型组基本形成类似银屑病样皮损。卡泊三醇组和鸦胆子苦醇給药组相较于模型组，银屑病样症状均有明显减轻，肉眼可见小鼠背部皮损鳞屑较少，红斑变浅，浸润增厚减轻，肉眼观察可见，除鸦胆子苦醇低剂量组恢复情况略微不及其他几组，鸦胆子苦醇高、中剂量组与卡泊三醇组银屑病样皮损症状减轻相似。

3.2 PASI评分 小鼠造模干预期间，依据银屑病面积和严重性指数评分法，并采用重复测量数据方差 分析进行统计分析并绘制趋势线，见下图２。正常对照组小鼠整个过程皮肤呈现红润光泽状态，模型组小鼠经咪喹莫特药物刺激，第二天即开始出现轻微的红斑，并伴随出现零星的小点状鳞屑同时测量到皮肤稍微增厚，随着持续给药时间增加，药物作用累积，模型组小鼠背部皮损逐步扩大严重，红斑面积增大颜色加深，鳞屑范围也逐步扩大，块状飞屑明显，且皮损厚度递增，至造模第7日，模型组小鼠基本形成类银屑病样皮损。卡泊三醇组及鸦胆子苦醇治疗组给药干预后，皮损情况较模型组都明显好转，红斑减轻变淡、鳞屑减少皮肤略显光滑及皮肤增厚浸润减轻， P <0.05。

3.3 组织病理改变 各组小鼠经7 d干预后，背部皮损经HE染色结果显示，正常对照组小鼠角质层不明显表皮光滑无增厚，皮脂腺规则无增大；模型组角质层明显增厚，角化不全伴角化过度，表皮增厚尤其是脊层，表皮突下伸，真皮浅层及乳头层炎症细胞浸润，整体表现与银屑病病理表现较一致。卡泊三醇组及鸦胆子苦醇高剂量组HE结果可见，角质层增厚情况较模型组明显减轻，且表皮平整，表皮突恢复平整，炎症细胞浸润减轻；鸦胆子苦醇中低剂量组病理改变较模型组也相对减轻，但好转情况略微不及卡泊三醇组及鸦胆子苦醇高剂量组。

3.4 Real-time PCR检测结果 与正常对照组相比，模型组NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、 IL-17的mRNA水平明显增加（ P <0.001）；与模型组相比，卡泊三醇组及鸦胆子苦醇高中低剂量组 NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、IL-17mRNA水平均明显下降，具有统计学意义（ P <0.001），见表2中mRNA数据。

3.5 Western blot检测结果 与模型组相比，卡泊三醇组及鸦胆子苦醇高、中、低剂量组NF-κB、 pNF-κB、CK10、TNF-α蛋白表达水平均明显下降 （ P <0.001），见图4。

3.6 ELISA 检测血清炎症因子 取小鼠血清，按照试剂盒说明对 IL-1β、IL-17、IL-6细胞因子水平进行检测。由下图5检测结果显示：与模型组相比，卡泊三醇组及鸦胆子苦醇高、中、低剂量组血清炎症因子IL-1β、IL-17、IL-6表达水平均明显下降（  * * * P <0.001），见下图5。

4 讨论

银屑病（psoriasis）是一种多基因遗传性的慢性、复发性、炎症性皮肤病  ［1］。该病常常起病隐蔽，病程久，缓慢加重，恶性与缓解交替，中医认为“邪之所凑，其气必虚”，“久病耗散”，中医认为“素体血热内盛，营血亏虚，肌肤失养，生风生燥”故而发病。主流学术观点认为初以热为主，久则虚，顽则瘀夹虚。2014年中成药银屑病治疗专家共识明确提出该病血热证、血燥证和血瘀证是基本证型。传统对于本病的外治方药，多沿用涂搽《医宗金鉴》的黄连膏；2014年专家共识提出以清热解毒、润肤止痒等中药软膏外涂，以安抚为主，避免刺激。大量的药理学已经证实，这些消肿定痛的清热解毒、清热凉血药的作用机理多在于抑制细胞的有丝分裂，促进颗粒层的形成，改善表皮的角化形成，从不全角化转为颗粒层形成的完全角化  ［7-8］。从目前病理来看，银屑病微血管增生和炎细胞浸润出现最早且与角质细胞过度增殖同样突出，针对这点，传统的清热解毒、润肤止痒的中药软膏的涂擦外治方法是无法解决的。

从中医药的理论出发，辨证施治，挖掘新的治疗 药物，将有可能提供一种全新的治疗手段。最早记载出自《本草纲目拾遗》：“鸦胆子，出闽、广，药肆中皆有之。形如梧子，其仁多油，生食令人吐，作霜，捶去油，入药佳”  ［9］。是中医外科治疗“寒凉箍围药”的经典代表药。鸦胆子具有多种药理活性，目前在临床上被广泛应用于肺癌、前列腺癌和胃肠癌的治疗。我国于 1978 年开始研制鸦胆子油静脉乳剂，并用于各种恶性肿瘤的治疗  ［10］。国内外学者对鸦胆子的化学成分和抗癌作用进行了大量的研究，充分证明其果实中所含的苦木内酯类成分是主要抗癌活性成分。迄今已从鸦胆子种子和全草中分离鉴定了150 多个化合物，70 余种单体，代表性化合物为鸦胆丁、鸦胆子苦醇、鸦胆子苷。鸦胆子苦醇为鸦胆子的主要成分，且毒副作用小，因而入选研究。

银屑病主要特征是角质形成细胞过度增殖和分化异常，微血管增生和炎细胞浸润。IL-17等与银屑病发病重要相关的炎症性细胞因子主要是由皮损中的TH17细胞分泌  ［11］，大量分泌的IL-17可以通过下调人胰岛源性蛋白 3 a，进一步起到角质形成细胞的分化抑制并促进其增殖，角质形成细胞进而合成分泌抗菌肽，募集炎症细胞的浸润，扩大炎症反应  ［12］。 NF-κB是一种广泛存在于哺乳动物组织细胞中的核蛋白，参与免疫 、炎症及细胞增殖等多种生物学过程。研究表明，NF-κB在银屑病皮损中及外周血单核细胞中均增加，高表达的NF-κB进一步诱导 IL-17和 TNF-α产生，起到下游炎症反应得放大作用。

本研究采用咪喹莫特诱导的balb/c小鼠银屑病模型，鸦胆子苦醇尾静脉注射进行干预治疗，实验结果显示，鸦胆子苦醇治疗后，小鼠银屑病样皮损明显减轻，高中低剂量组PASI评分较模型组均有明显好转， P <0.05，HE结果显示鸦胆子苦醇治疗组角质层增厚情况较模型组明显减轻，且表皮平整，表皮突恢复平整，炎症细胞浸润减轻。Real-time PCR、  Western blot 及ELISA结果经治疗后，NF-κB、TNF-α、 IL-17等相关炎症因子及CK1、CK10等细胞增殖相关因子均明显表达下调。说明鸦胆子苦醇可能通过 NF-κB及相关炎症因子信号通路调控有效抑制角质细胞过度增殖，减轻炎症反应从而改善了银屑病小鼠皮损症状。

本试验探究了鸦胆子苦醇治疗银屑病的初步疗效，检测了潜在相关信号通路，为进一步探究其具体作用靶点打下基础，为中医药防治银屑病提供理论和实验依据，为提高中医药治疗银屑病疗效寻求的新的途径，为中医药防治银屑病的早期诊断、治疗与预后都具有深远的意义。

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（收稿日期：2022-10-26）