布氏杆菌和羊口疮血清抗体的检测与分析

魏 敏,龙宥茨，张煜杭，姬格金，梁 倩，鲜思美

贵州大学动物科学学院预防兽医实验室，贵州贵阳 550025

羊布氏杆菌病（羊布病），是一种由布氏杆菌感染引起的具有较强传染性的慢性传染病，危害性强且流行范围广。病菌通过呼吸道、生殖系统、消化道进行传播。人和家畜接触或是食用了羊肉、羊奶，甚至是吸入带病菌的灰土都会被传染。此病对妊娠期间的母畜危险性较大，可导致母畜流产，易发生子宫内膜炎，影响后期受孕。公羊感染会发生睾丸炎、睾丸萎缩，导致公羊行走不畅，繁衍能力消失。羊口疮，又称传染性脓疱，是由羊口疮病毒引起绵羊、山羊的急性、接触传染性、嗜上皮性的人兽共患病。OrfV 可通过损伤的皮肤或黏膜感染动物，在口、唇、舌、鼻、乳房等部位的皮肤和黏膜会形成丘疹、水疱、脓疱、溃疡，最后结成疣状厚痂。绵羊和山羊为主要的感染动物，尤其是3 ～6月龄的羔羊最为敏感，群体感染性高，致死率高。布鲁氏杆菌病和羊口疮均是人兽共患传染病，疫病的发生不仅给羊产业带来巨大的经济损失，而且威胁人类健康，存在社会公共卫生安全隐患。因此开展羊血清中布病和羊口疮抗体的检测具有重要意义。本试验采用虎红平板凝集试验和间接ELISA 方法对临床上采集的423 份羊血清样本进行了布氏杆菌和羊口疮抗体的检测，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 血清样本

423 份羊血清样本（布鲁氏杆菌疫苗未免疫羊血清样本423 份，羊口疮疫苗免疫羊血清样本243份、未免疫羊血清样本180 份）均由贵州大学动物疫病研究室保存。

1.1.2 主要试剂

布氏杆菌病标准阳性血清及阴性血清、布氏杆菌病虎红平板凝集抗原购自青岛易邦生物工程有限公司；羊口疮病毒B2L-F1L 截短融合蛋白由贵州大学动物疫病研究室制备保存；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；TMB 显色液、酶标条购自Solarbio 科技有限公司；HRP 标记兔抗山羊IgG 购自重庆奥怡生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虎红平板凝集试验检测羊布氏杆菌

在虎红平板反应纸卡上，取被检血清30 µL 与布鲁杆菌凝集抗原30 µL 相混合，同时以布氏杆菌标准阴性、阳性血清作为对照，在5 min内观察结果。液体混合物出现卷边、肉眼可见的凝集物，判定为阳性；液体混合物均匀浑浊、无凝集物形成，判定为阴性。

1.2.2 B2L-F1L 截短融合蛋白浓度测定

采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒对纯化后保存的rB2L-F1L 融合蛋白进行浓度测定。

1.2.3 基于羊口疮病毒B2L-F1L 截短融合蛋白的间接ELISA 方法检测血清抗体

采用本实验室前期研究建立的基于羊口疮病毒B2L-F1L 截短融合蛋白的间接ELISA 方法检测血清样本。间接ELISA 的最佳反应条件：rB2L-F1L 蛋白抗原最佳包被量为0.25 µg/mL，5%脱脂奶粉封闭1 h，血清最佳稀释倍数1:200，一抗及酶标二抗最佳孵育时间为1 h，酶标二抗的最佳工作浓度为1:8 000，TMB 最佳显色时间为15 min，OD450nm值≥0.358 判为阳性，反之则判为阴性。具体操作如下。

①包被：取纯化的rB2L-F1L 融合蛋白，将蛋白用包被液稀释浓度为0.25 µg/mL，4 ℃过夜包被于96 孔板中，每孔100 µL。

② 洗涤：弃去包被液，用PBST 洗板3 次，每次3 min，并在吸水纸上拍干。

③ 封闭：每孔加入5 %的脱脂奶粉200 µL 于37 ℃封闭1 h。

④ 洗板：弃去多余的液体，用PBST 洗板3 次，每次3 min，并在吸水纸上拍干。

⑤ 一抗孵育：将待检血清分别加入96 孔板中，每孔100 µL，37 ℃孵育1 h。

⑥ 步骤同4。

⑦ 二抗孵育：每孔加入100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊IgG(1:8 000)，37 ℃孵育1 h。

⑧ 步骤同4。

⑨ TMB 显色：每孔加入100 µL 的TMB 显色液，37 ℃避光显色15 min；加入50 µL 的终止液终止显色，酶标仪读取OD450nm 值。

2 结果

2.1 虎红平板凝集试验检测羊布氏杆菌病结果

采用虎红平板凝集试验对临床上采集的羊血清样本进行检测，布氏杆菌标准阳性血清样本出现凝集物，阳性对照成立；423 份羊血清样本与标准阴性血清对照结果相同，即液体均匀浑浊、未见凝集物，即判定为羊布病抗体阴性。

2.2 基于羊口疮病毒B2L-F1L 截短融合蛋白间接ELISA 检测羊口疮抗体结果

2.2.1 B2L-F1L 截短融合蛋白浓度测定结果

采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒对纯化后保存的B2L-F1L 蛋白进行浓度测定，B2L-F1L 蛋白浓度为135 µg/mL，将蛋白进行1:540 倍稀释为ELISA 方法蛋白包被的使用浓度0.25 µg/mL。

2.2.2 间接ELISA 检测羊口疮血清抗体结果

采用间接ELISA 方法检测423 份临床采集的羊血清样本，羊口疮阴性血清和阳性血清对照各2 孔。阴性血清对照孔的OD450nm 分别为0.163 和0.142，OD450nm 值＜0.358；阳性血清对照孔的OD450nm 分别为0.574 和0.652，OD450nm 值＞0.358；表明本试验的阴、阳性对照成立。检测出羊口疮疫苗免疫羊血清样本阳性率为62.55%（152/243），未免疫羊血清样本阳性率为14.44%（26/180）。

3 讨论

布鲁氏菌病为我国二类动物疫病，传播速度快、范围广，目前全国羊群布病感染率呈上升趋势，羊群布病防控形势较严峻。血清学试验如试管凝集试验、虎红平板凝集试验（RBT）、补体结合试验和间接酶联免疫吸附试验（ELISA）等是诊断和检测布病的常用方法。其中RBT 具有易携带、操作简便、成本低、检测速度快、结果易观察等优点而被广泛应用于基层的大面积布病筛查，然而该方法存在着“前带现象”、假阳性高且判断结果存在主观影响等缺点。

OrfV 通常可感染所有年龄段的绵羊和山羊，其它各种反刍动物和哺乳动物，如骆驼、犬以及人等均有OrfV 感染的报告。目前，有许多方法可以对羊口疮病毒感染进行检测，如病原学检测方面有病毒分离鉴定以及常规和实时荧光定量PCR 等；血清学检测方面有血清中和试验和ELISA 等。间接ELISA 方法是检测OrfV 抗体的重要手段，Bora 等使用全病毒为包被抗原建立了检测羊血清中OrfV抗体的间接ELISA 方法[1]，刘丽佳、张静等将OrfV B2L 基因进行截短以表达优势抗原表位区建立了间接ELISA 方法。本试验以纯化的rB2L-F1L 蛋白作为包被抗原建立间接ELISA 方法（该技术已获得发明专利授权，ZL202110360839.6）对临床血清样本进行检测。由于目前OrfV 尚无商品化的ELISA 试剂盒，故本试验未能进行临床样品符合率的比对研究。

我国陕西、西藏、四川、新疆、甘肃、云南、贵州等地区均有羊布氏杆菌病和羊口疮的疫情暴发，目前针对两种疾病均无特效药治疗，主要采取疫苗免疫进行防控。根据国家发布的布氏杆菌病相关政策，贵州省是我国布病防控二类地区,原则上不实施免疫。但贵州省羊群布氏杆菌病感染率较高，因此先要对羊群进行布氏杆菌病筛查,以防从业人员感染布病。目前羊口疮病未列入国家免疫强制计划，且暂无特效药，主要使用弱毒疫苗和灭活疫苗进行预防免疫，但弱毒疫苗会存在毒力返强、活病毒免疫逃避、免疫后抗体水平不高等缺点。灭活苗仅限于已发生过羊口疮的羊场使用。为了解采样羊群布氏杆菌病和羊口疮抗体水平，本试验采用虎红平板凝集试验和纯化的rB2L-F1L 蛋白作为包被抗原建立间接ELISA 方法对临床上采集的423 份羊血清样本（布鲁氏杆菌疫苗未免疫羊血清样本423 份；羊口疮疫苗免疫羊血清样本243 份，未免疫羊血清样本180 份）进行布氏杆菌和羊口疮的抗体水平检测。结果显示，羊布氏杆菌病抗体阴性，羊口疮疫苗未免疫羊血清样本阳性率为14.44%（26/180），再结合流行病学调查情况和临床症状，表明羊群不存在布氏杆菌感染，但存在羊口疮病毒感染。