针灸干预呼吸机相关性肺炎模型大鼠及NETs机制的研究*

黄 杰 张巧梅 邓扬嘉

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410036；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000；3.重庆市中医院，重庆 400011）

呼吸机相关性肺炎（VAP）指气管插管或气管切开患者接受机械通气48 h 后发生的肺炎，是导致患者脱机困难、住院时间延长、治疗费用增加的疾病［1-2］。研究发现：NETs 水平可作为反映肺组织损伤的重要指标［1-3］；肠源性感染患者感染状态可用NETs 水平来反映［1］。故我们推测，同样属于感染性疾病的VAP，NETs可能参与其发病机制。

针灸通过穴位刺激，具有疏通经络、扶正祛邪等作用［2］。艾灸通过温热刺激，激活穴位局部的热敏感免疫细胞、特异感受器等，达到温通温补的作用［3］。刘兵等提出针灸介入防治COVID-19 的可行性与可靠性，并提出了独特“针灸方案”［4］。研究发现在常规治疗基础上温和灸治疗呼吸机相关性肺炎的疗效显著，可减轻肺部感染［5］。本研究利用VAP 模型大鼠，初步探索针灸减少VAP 模型大鼠炎性反应的作用机制，为深入研究针灸、NETs抑制剂预防和治疗VAP患者的可能机制提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级成年雄性健康大鼠，体质量（300±10）g，由成都药康生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2020-034。SD 大鼠自购回后保持其自由饮水、进食，温度21～25 ℃，适应性喂养1 周后进入实验。实验设计经重庆威斯腾生物实验动物福利伦理委员会审议同意并批准。

1.2 试药与仪器

NETs 抑制剂（盐酸尼索西汀）。大鼠CITH3 酶联吸附测定试剂盒：江莱生物（中国，JL47058）。MPO 比色法测试盒：伊莱瑞特，武汉（CAT：E-BC-K074-M）。Sytox Green：美国Thermo Fisher（S7020）。PBS：上海生工，中国（B040100）。RPMI-1640 培养基：美国Gibco（A4192301）。一次性毫针（华佗牌，0.25 mm×25 mm），艾条（南阳市汉艾艾制品有限公司）。小动物呼吸机：安徽正华生物仪器设备有限公司（DW-3000 型）。酶联免疫检测仪：美国Thermo Fisher。低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。显微外科手术器械包：上海手术器械厂（SSW-3型）。

1.3 分组与造模

将80 只成年雄性健康SD 大鼠分为对照组、模型组、针灸组、针灸+NETs 抑制剂组，每组20 只。20%乌拉坦腹腔注射麻醉，取仰卧位，使用喉镜将气管导管插入声门，通过听双肺呼吸音确定导管插在气管内，于大鼠口腔行气管插管后接小动物呼吸机，呼吸机参数设定为：潮气量（V）12 mL/kg，呼吸频率70次/min，吸入氧浓度（FiO2）1.0。连续通气48 h后，5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，竖起固定板＞45°，以微量注射器经气管导管注入0.2 mL 3×108cfu/L 铜绿假单胞菌（PA）菌液和0.55 mL 气体，并保持体位5 min。经气管注入PA 菌液6 h 后，检测大鼠肺组织病理变化呈小叶性肺炎特征，肺泡灌洗液和肺组织中的PA 细菌培养阳性［6］，以确保成功诱导出大鼠VAP模型。

1.4 针灸及给药方法

针灸组、针灸+NETs 抑制剂组取大鼠穴位定位参考《实验动物常用穴位名称与定位》第2 部分：大鼠［7］。肺俞：第3 胸椎下两旁肋间，背正中线旁开6 mm。大椎：第7 颈椎与第1 胸椎间，背部正中。风门：第2 胸椎下两旁肋间，背正中线旁开6 mm。大椎直刺5 mm，肺俞、风门各斜刺6 mm，留针30 min，运用平补平泻手法每10分钟行针1次，每日2次，共7次；针刺治疗结束后将点燃的艾条，距相同穴位皮肤表面2 cm 处施温和灸，施灸15 min，每日2 次，共7 次。针灸+NETs 抑制剂组按体质量0.8 μmol/L/290～340 g 的剂量鞘内注射NETs抑制剂。

1.5 标本采集与检测

麻醉状态下腹主动脉采血，放于无抗凝管中静置1～2 h 后离心（3 000 r/min，20 min，4 ℃），吸取上层血清-20 ℃保存用于ELISA 检测。采用经预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）进行大鼠肺泡灌洗，收集灌洗液，离心后置于-20 ℃保存用于ELISA检测。

1.5.1 激光共聚焦检测大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表达差异 佛波酯（PMA）诱导NETs形成：1）将细胞接种于培养孔板爬片中，加入PMA使其终浓度为300 ng/mL，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养3 h；2）孵育结束后，加入Sytox Green 和Hochest 混合染色液37 ℃染色5～10 min；3）染色结束后用PBS 清洗1 次，用4%多聚甲醛室温固定10 min；4）固定结束后用PBS 清洗1 次，加入封片剂进行封片，共聚焦观察。

1.5.2 ELISA 检测大鼠H3 表达 从室温平衡60 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃。设置标准孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。样本孔中加入待测样本50 μL，空白孔加样本稀释液50 μL，空白孔，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板模封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，吸水纸上拍干，重复洗板5 次。每孔加入底物A、B 各50 μL，15 min 内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.5.3 MPO 测定 1）对照管：取350 μL 双蒸水、20 μL待测样本、20 μL试剂五（澄清剂）加入1.5 mL EP管中。测定管：取20 μL待测样本、20 μL试剂五，350 μL显色剂加入1.5 mL EP 管中。2）涡旋混匀3 s，37 ℃准确反应30 min。3）向2）中各管加入5 μL试剂八（酸试剂），涡旋混匀3 s，60 ℃水浴10 min。4）取出后，3 000×g，离心10 min。5）取300 μL 上清液于酶标板中，酶标仪460 nm处，测定各孔OD值。

1.5.4 H3 的测定 绘制标准物和OD 值的回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。参照文献［8］测定MPO。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表达差异

见图1。激光共聚焦显微镜下，中性粒细胞在接受PMA刺激4 h后，产生大量绿色细胞外网络结构，从显微结构和组成成分上可鉴定为NETs（图中红色虚线处）。VAP 大鼠模型外周血和肺泡灌洗液中均存在NETs，外周血中明显高于肺泡灌洗液中，在4组的分布中，模型组＞针灸组＞针灸+NETs抑制剂组＞对照组。

图1 各组大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表达（400倍）

2.2 各组大鼠肺泡灌洗液中H3、血清中H3水平比较

见表1。与对照组比较，模型组、针灸组、针灸+NETs 抑制剂组肺泡灌洗液、血清中H3 表达均明显增高（P＜0.05）。与模型组比较，针灸+NETs 抑制剂组肺泡灌洗液、血清中H3 表达明显降低（P＜0.05），针灸组肺泡灌洗液、血清中H3 表达相近（P＞0.05）。与针灸组比较，针灸+NETs 抑制剂组肺泡灌洗液、血清中H3表达明显降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠肺泡灌洗液、血清H3、MPO比较

2.3 各组肺泡灌洗液中MPO、血清中MPO比较

见表1。对照组比较，模型组、针灸组肺泡灌洗液、血清中MPO 表达均明显增高（P＜0.05），针灸+NETs抑制剂组肺泡灌洗液、血清中MPO 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，针灸组、针灸+NETs 抑制剂组肺泡灌洗液、血清中MPO 表达均明显降低（P＜0.05）。与针灸组比较，针灸+NETs 抑制剂组肺泡灌洗液、血清中MPO表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

ICU 中患者常需要接受机械通气治疗，其可以有效纠正患者呼吸功能障碍，改善患者肺部通气量，是ICU救治工作中重要组成部分，但患者较易发生VAP［9-10］。而对于VAP 治疗主要是使用抗生素为主的综合治疗，随着多重耐药细菌的产生，其治疗难度增加。Castanheira FVS 研究发现当炎症反复发生或刺激物持续存在时，过度的NETs 会造成组织损伤［11］。研究发现，NETs 参与急性呼吸窘迫综合征患者肺损伤的形成机制［12］。Fousert E 等提出NETs 过量产生或清除不及时可参与多种炎症性疾病的发病过程［13］。VAP 脱机困难的一个重要原因即炎症反复发作、抗生素反复使用致抗感染无效，进而发展成急性肺损伤，因此，我们推测，对于炎症反复的VAP，NETs 也参与其发病机制。所以如何减少过度的NETs 是治疗包括VAP 在内的炎性疾病的一种新的研究方向。

中医学尚无关于VAP 的病名诊断，但根据其症状，可归属于“咳嗽”“发热”等范畴。《黄帝内经》云“正气存内，邪不可干”，需机械通气的患者往往因久病导致其正气亏虚，御邪无力，邪毒乘虚而入，肺失清肃；肺主宣降，通调水道，肺失清肃则水道不通，积聚成痰，痰郁而化热，痰热互结，壅闭于肺，患者主要以发热、咳嗽、气促等为临床表现［14］。

基于以上实验结果及NETs 在VAP 模型大鼠的可能机制，我们使用了针灸和NETs 抑制剂两种方式对VAP模型大鼠进行干预。本研究针灸选穴肺腧属足太阳膀胱经，刺之可补益肺脏，止咳平喘，起到扶正之功；大椎属督脉，为手足三阳经与督脉的交会穴，被称为“诸阳之会”，统摄一身之阳，是邵老治疗肺系病的要穴［15］，刺之可清泻肺热，起到祛邪之用，两个穴位相互配合，共奏扶正祛邪之效；风门属足太阳膀胱经，为风邪出入之门户，搜风要穴，主治感冒、咳嗽、发热等外感病症、肺系病症，刺之可疏风解表、宣肺平喘［16］，以上诸穴相互配合，增强VAP 患者正气，使外邪不再侵入的同时祛除体内毒邪。

本研究发现NETs 确实存在于VAP 模型大鼠中，并且导致模型大鼠炎症恶化。本研究中模型组和针灸组，模型组和针灸+NETs抑制剂组的肺泡灌洗液、血清中MPO 水平存在明显差异，而针刺组和针灸+NETs 抑制剂组的肺泡灌洗液、血清中MPO 水平表达相近，故我们推测针灸对于减少肺泡灌洗液、血清中MPO 水平优于NETs 抑制剂；而针灸减少VAP 模型大鼠的NETs的机制可能是通过降低其肺泡灌洗液、血清中MPO 水平来实现的。模型组和针灸+NETs抑制剂组的肺泡灌洗液中H3、MPO 水平、血清中H3、MPO 水平均存在明显差异，故我们推测针灸+NETs 抑制剂协同减少模型大鼠NETs的表达，其机制可能是通过降低肺泡灌洗液及血清中MPO、H3的水平来实现的，其中，尤以肺泡灌洗液及血清中MPO水平为著。

本研究的局限和展望：1）尽管盐酸尼索西汀溶液可有效降低NETs的水平，但使用转基因动物可以进一步增加研究结果的可信度。2）本研究模型组和针灸组肺泡灌洗液及血清中H3水平无明显差异，而杜沂岚等发现经肺腧穴中药离子导入联合振动排痰干预慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者疗效确切［17］。有研究报道电针足三里穴预处理可诱导大鼠对肺损伤的耐受性［18］，可以显著减轻大鼠肺组织损伤程度，同时抑制肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-β）的表达［19］，下一步研究有望通过在针灸的基础上配合腧穴中药离子导入及电针治疗，可能会得出更多阳性结果，进一步降低VAP 大鼠NETs 水平，丰富VAP 的治疗方式。3）刘芬等通过提取大鼠肺组织胞外囊泡（Ti-EVs）后发现，Ti-EVs 组肺内NETs 荧光强度较脓毒症组明显增加，Ti-EVs 加重肺内炎症反应，促进NETs 形成［20］。这可能提示减少Ti-EVs 也会减少NETs 的形成，进而减轻炎症反应，对于同样存在NETs 的VAP，Ti-EVs 可能也存在于其发病机制中，下一步研究可以尝试减少Ti-EVs 的形成，进一步探索预防和治疗VAP的新方法。