芪蛭通脉颗粒对冠心病模型大鼠MMP-9/TIMP-1影响的研究*

佟晴晴 赵 淳 李 易 叶 勇 柳 尧 宋欠红△

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021）

芪蛭通脉颗粒是第三、四、五、六批全国名老中医药专家学术经验继承工作指导老师赵淳教授的经验方，经优化剂型而成。本研究团队对芪蛭通脉颗粒进行的前期研究结果显示：气虚血瘀证之冠心病患者应用芪蛭通脉颗粒后可以明显减轻气短、胸闷、胸痛等症状，并有明确的调节血脂作用［1-2］。我们前期研究发现芪蛭通脉颗粒能通过调控前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）/低密度脂蛋白受体（LDLR）及血管细胞间黏附分子1（VCAM-1）/细胞间黏附分子-1（ICAM-1）信号通路降低大鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TAG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，具有调节血脂的作用。该方还可以调控TLR4/NF-κB 信号通路，抑制动脉粥样硬化模型大鼠冠状动脉炎症反应［3］。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的平衡是反映动脉粥样硬化稳定性的重要指标［4］。本实验通过观察芪蛭通脉颗粒对冠心病模型大鼠血清及心肌组织MMP-9、TIMP-1 表达水平的影响，分析血清、心肌组织中MMP-9、TIMP-1 含量及相关性，探讨该方治疗冠心病的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只Wistar雄性健康大鼠，SPF级，体质量200～250 g，购于昆明医科大学动物中心。实验动物生产许可证号：SCXK（滇）2018-0003。大鼠合格证号：430067000017126。对大鼠进行适应性饲养1周。

1.2 药物 自拟方芪蛭通脉颗粒由黄芪20 g，灯盏细辛15 g，红曲6 g，三七6 g，水蛭粉3 g组成，以上均为配方颗粒（四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：2008029）。对照药物血塞通滴丸（昆药集团药业有限公司，5 mg/粒，批号：2001820）。垂体后叶素注射液（上海禾丰制药股份有限公司，6 U/mL，批号：2002014）。注射用异戊巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，0.25 g/10 mL，批号：20201006）。

1.3 试剂与仪器 MMP-9、TIMP-1 ELISA 试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号：20200714、20200710）、电子分析天平产自德国sartorius 公司（CX-BA 型）。酶标仪型号：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo公司；高通量组织研磨器：上海豫明YM-80LD。PT、APTT、TT、FIB 检测试剂盒（上海太阳生物科技有限公司.批号：B202012023、B202011011、B202012021、B202012013）。谷丙转氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）检测试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号：20201014、20200910、20201010）。

1.4 造模与分组 60 只大鼠按随机数字表法分为6组，空白组、模型组、血塞通滴丸组以及芪蛭通脉低、中、高剂量组，每组10 只。在潘继兴制作冠心病模型大鼠的基础上进行改良，建立冠心病动物模型［5］。除空白组之外的其余各组均给予高脂饲料喂养。具体配方为：胆固醇3%，猪油15%，胆酸钠1%，丙硫氧嘧啶1%，基础饲料80%。连续喂养8 周，按5 mL/kg 液体量每日灌胃2 次，空白组给予等量纯净水灌胃。从第8 周第4 日开始，除空白组之外的其余组给予垂体后叶素（每次3 U/kg，每日1 次）腹腔注射，连续给药3 d；空白组继续予以等量纯净水灌胃。在给药第3日，于注射药物后30 min 内对大鼠进行心电图检测，若大鼠心电图存在QRS 波群的终点与ST 段交接处的J 点位移，且位移＞0.1 mV，则表明大鼠存在心肌缺血，以及心电图ST 段抬高大于0.1 mV，并且心律不齐，则表明造模成功［6］。

1.5 干预方法 于第9周开始给药，共干预治疗28 d。实验动物与健康人用药量的换算方法：给药剂量（g/kg）=给出的人的剂量（g/kg）×70 kg×系数（0.018）×（1/0.2）。除空白组和模型组予等量纯净水灌胃外，芪蛭通脉低、中、高剂量组分别予以相应剂量芪蛭通脉水溶液给药，血塞通滴丸组给予血塞通滴丸水溶液灌胃。

1.6 取材 药物干预4 周后进行检测，将大鼠按体质量予以1%异戊巴比妥钠40 mg/kg 剂量腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，使大鼠呈仰卧位，对大鼠皮肤进行消毒，暴露大鼠腹主动脉，采血5 mL，于室温2 500 r/min离心20 min，取上清液即血清分装于1.5 mL 的ependor管中，放入-20 ℃冰箱保存，切开大鼠胸部皮肤、胸大肌、肋骨、取出心脏，每个心脏取左心室室壁3×3 mm心肌2块，放入-80 ℃冰箱保存待检。

1.7 血清及心肌组织相关指标 凝血四项检测［活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白酶（FIB）］：按照试剂盒说明书进行检测。检测血清ALT、BUN、Cr水平。剪取左心室心肌组织3×3 mm，研磨后用酸盐缓冲液制成心肌组织匀浆液，离心后取上清液，ELISA法检测心肌组织MMP-9、TIMP-1［7-8］。

1.8 统计学处理 应用SPSS22.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，运用方差分析进行统计学处理，计量资料采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清MMP-9、TIMP-1 水平的比较 见表1（模型组大鼠死亡2 只，芪蛭通脉中剂量组大鼠死亡1 只）。与空白组比较，模型组、血塞通滴丸组、芪蛭通脉低、中剂量组大鼠血清MMP-9 水平升高（P＜0.05）；芪蛭通脉中、高剂量组、血塞通滴丸组与模型组比较MMP-9 水平降低（P＜0.05）。与空白组比较，模型组大鼠血清TIMP-1 水平降低（P＜0.05）；芪蛭通脉中、高剂量组大鼠血清TIMP-1 水平升高（P＜0.05）。芪蛭通脉中、高剂量组与模型组比较，TIMP-1 水平升高（P＜0.05）；芪蛭通脉中、高剂量组与血塞通滴丸组比较TIMP-1水平升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血清中MMP-9、TIMP-1表达水平比较（ng/mL，±s）

表1 各组大鼠血清中MMP-9、TIMP-1表达水平比较（ng/mL，±s）

注：与空白组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

TIMP-1 22.69±2.35 13.41±3.05*17.61±3.39 18.58±3.32 29.52±4.12*△△28.93±3.55*△△组 别空白组模型组血塞通滴丸组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组n 10 8 10 10 9 10 MMP-9 26.60±2.95 48.53±7.22**41.89±5.16**△42.24±6.31**36.91±4.17*△32.79±3.92△△

2.2 各组大鼠心肌组织MMP-9、TIMP-1水平比较 见表2。芪蛭通脉中、高剂量组，血塞通滴丸组与模型组比较，MMP-9 水平均降低（P＜0.05）。与空白组比较，模型组、芪蛭通脉低剂量组大鼠心肌组织TIMP-1水平降低（P＜0.05）；芪蛭通脉中剂量组与空白组比较TIMP-1 水平升高（P＜0.05）。芪蛭通脉中、高剂量组与模型组比较TIMP-1水平显著升高（P＜0.01）。

表2 各组大鼠心肌组织MMP-9、TIMP-1水平比较（ng/mL，±s）

表2 各组大鼠心肌组织MMP-9、TIMP-1水平比较（ng/mL，±s）

组 别空白组模型组血塞通滴丸组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组n 10 8 10 10 9 10 MMP-9 3.58±0.57 20.31±3.12**17.66±3.21**16.33±3.54**7.20±2.06**△9.54±2.24**△TIMP-1 2.42±0.35 1.02±0.24*1.63±0.32 1.54±0.55*3.69±0.61*△△2.78±0.84△△

2.3 各组大鼠凝血功能指标比较 见表3。各组间凝血功能检测未见明显差异（均P＞0.05）。

表3 各组凝血功能指标比较（±s）

表3 各组凝血功能指标比较（±s）

组 别空白组模型组血塞通滴丸组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组n 10 8 10 10 9 10 APTT（s）23.74±5.56 25.31±6.43 28.62±5.24 30.52±6.28 29.87±6.77 26.32±5.01 PT（s）10.70±1.02 9.11±1.23 11.02±2.24 10.25±2.09 11.54±2.74 9.18±2.55 TT（s）11.70±1.19 10.85±1.02 12.03±1.56 10.93±0.99 12.15±1.45 11.40±1.32 FIB（g/L）2.64±0.32 3.31±0.76 3.25±0.47 4.83±0.61 4.50±0.99 3.69±0.25

2.4 各组大鼠ALT、BUN、Cr水平比较 见表4。与空白组比较，模型组ALT 水平升高（P＜0.05），各组间BUN 水平差异无统计学意义（P＞0.05），其他所有组Cr水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，血塞通滴丸组ALT水平降低，芪蛭通脉高剂量组Cr水平下降（均P＜0.05）。

表4 各组大鼠ALT、BUN、Cr水平比较（±s）

表4 各组大鼠ALT、BUN、Cr水平比较（±s）

组 别空白组模型组血塞通滴丸组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组n 10 8 10 10 9 10 ALT（U/L）43.74±5.56 65.31±7.43*43.62±5.24△55.52±6.28 49.87±6.77 56.32±8.01 BUN（mmol/L）7.70±1.02 10.11±1.23 11.02±2.24 10.25±2.09 11.54±2.74 9.18±2.55 Cr（μmol/L）53.64±6.32 101.31±13.76*88.25±13.47*93.83±10.61*114.50±11.99*78.69±10.25*△

3 讨 论

冠心病属中医学“胸痹”“心痛”范畴，多表现为胸部有短暂的压榨性疼痛或有憋闷感，其基本病机为心脉痹阻，为本虚标实之证［9］。络病理论对胸痹心痛治疗具有重要指导意义，其最早见于《黄帝内经》。由吴以岭教授推动“络病证治”进入到“脉络学说”新阶段，创立“三维立体网络系统”成为现代络病学理论基础［10］。经是经络系统的主体，而络是由经分出的行于浅表的支脉，经络共同构成了人体气血运行的通道。血管及毛细血管、微血管等在解剖形态和功能上与中医学中“经络”联系密切，人体运行血液的循环及微循环系统与运行气血的脉络共同形成了“脉络-血管系统病”“孙络-微血管病”等新概念［11］。许多具有心绞痛症状，且心电图多数导联呈ST 段压低提示有心肌缺血或心肌标志物异常反映心肌坏死，而冠状动脉造影未见异常的患者大多与冠状动脉微循环障碍有关［12］。2013 年欧洲心脏病学会在冠心病原本定义的基础上加入了冠脉微血管功能障碍导致的胸部症状［13］，主要依靠功能评估来判断冠脉微循环功能状态。

冠脉微循环具有调节心脏血流分布，满足心肌代谢需要以及调节外周血管阻力的功能［14］。冠状动脉微循环的结构和功能改变使冠状动脉血流储备受损，引起心肌缺血，血管痉挛、内皮功能障碍、血管重构、毛细血管密度降低、血管周围纤维化、再灌注损伤等原因导致冠脉微循环障碍［15］。冠脉微循环在生理结构及功能上相当于心脏的孙络，冠脉微循环功能障碍属于络病理论中的“孙络-微血管病”。血脂异常会损伤血管内皮，血管内皮细胞受损后，血管内壁中脂质迁移沉积，形成斑块并不断加重，同时血液黏度增加，促使血小板黏附、聚集，诱导血栓形成，使外周微循环受损［16］；动脉粥样硬化斑块的稳定程度和纤维帽的薄厚密切相关［17］，而纤维帽的主要成分是细胞外基质（ECM），基质金属蛋白酶（MMPs）能够降解ECM，使纤维帽变薄，斑块更易破裂。MMP-9 是其家族中重要一员，大量存在于易损斑块中。TIMP-1 是MMP-9 的特异性抑制剂，可反映抑制胶原降解的程度。两者的动态平衡是维持动脉硬化斑块稳定的关键因素［18］。

对基于络病理论指导下所组方药的相关研究表明，通络的方药可保护微血管内皮细胞，改善内皮舒缩功能［19］。治疗冠心病宜采用活血通络之法，改善血液循环，使血运通畅，通则不痛，缓解胸痛症状。芪蛭通脉由炙黄芪、灯盏细辛、三七、红曲、水蛭粉等组成，具有益气活血化瘀、通络止痛之效。根据药理研究，本方药物具有抗凝血、改善血液循环、保护微血管内皮细胞，加速胆固醇代谢等作用［20］。

本研究表明，模型组大鼠血清及心肌组织中MMP-9均升高，TIMP-1水平均降低，芪蛭通脉中、高剂量组能明显降低血清及心肌组织MMP-9 水平，并提高血清及心肌组织TIMP-1水平，MMP-9/TIMP-1比值有良好的相关性，其相关性在血清中表达更为明显，这表明血清中MMP-9、TIMP-1 含量对检测患者斑块稳定程度具有重要意义；与此同时，芪蛭通脉中、高剂量组对MMP-9/TIMP-1 的调控作用明显，其可能作用机制是抑制MMP-9 的释放的同时促进TIMP-1 生成，促进生成MMP-9/TIMP-1 复合物，抑制ECM 降解。根据APTT、PT、TT、FIB 检测结果，芪蛭通脉低、中、高剂量组未导致凝血功能异常。此外，模型组大鼠ALT、Cr升高，肝、肾功能有一定损伤，用血塞通滴丸干预后，肝、肾功能有一定程度的恢复，而芪蛭通脉低、中、高剂量组与血塞通滴丸组相比较没有明显肝肾损害，其作用机制有待进一步研究。

芪蛭通脉可以抑制MMP-9 释放以及促进TIMP-1生成，抑制ECM 降解，稳定斑块，防止斑块破损，减少血栓形成，维持心脏血液循环，使冠脉循环障碍得到有效缓解；而芪蛭通脉对冠脉微循环障碍的改善程度有待进一步研究。