不同剂量的地龙提取物对肺纤维化小鼠肺组织波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达水平及纤维化程度的影响▲

陈 宏 王文增 李可心 王玉叶 张明浩 邓琳千 张佩颖 赵建云 陈 群

(1 黑龙江中医药大学附属第一医院儿一科,黑龙江省哈尔滨市 150040;黑龙江省哈尔滨市阿城区人民医院2 神经内科,3 检验科,黑龙江省哈尔滨市 150300)

肺纤维化是一种肺间质性疾病,是结缔组织病的常见并发症,其发病机制及诱因复杂,主要的病理过程为纤维细胞病理性增生分化为肌成纤维细胞,导致肺组织增厚,肺泡通气量减少,进而引起呼吸困难和呼吸衰竭等症状[1-2]。目前尚无治疗该病的特效药物,患者预后较差,病死率高,且近年来发病率呈逐年上升趋势[3]。西医治疗肺纤维化的常用药物为吸入激素类气雾剂、色甘酸钠气雾剂等,这些药物虽然起效快,但长期服用容易产生耐药性,而停药后在诱因作用下容易导致疾病复发。中医认为肺纤维化属于“络病”范畴,肺络瘀阻是肺纤维化进展的主要病机。地龙是我国重要的中药材之一,其是蚯蚓的干燥体,富含多种氨基酸,具有清热定惊、通络、平喘的功效[4],用于治疗肺纤维化时可以发挥化痰散结、活血化瘀、消症解毒、补益肺肾的作用。研究表明,波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白参与了肺纤维化的发生、发展[5-6]。我们推测,地龙可能通过调节波形蛋白及α-平滑肌肌动蛋白的表达而改善肺纤维化。为此,本研究探讨不同剂量的地龙提取物对肺纤维化小鼠模型肺组织波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达水平及纤维化程度的影响,为地龙提取物治疗肺纤维化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性C57小鼠90只,8～10周龄,体重(22.3±3.5)g,购于青龙山动物繁殖中心[许可证号:SCXK(苏)2017-0001],饲养于黑龙江中医药大学附属第一医院动物实验中心,环境温度(23.0±1.5)℃,相对湿度(50.0±3.5)%,自由饮食。本研究遵循实验动物护理指南的原则,并已通过黑龙江中医药大学附属第一医院动物实验伦理审查委员会审查及批准。

1.2 主要实验试剂 百草枯(北京百灵威科技有限公司,批号:2020-35-5;浓度>98%);地龙干燥饮片(广东天诚中药饮片有限公司,批号:2020-20-8);波形蛋白一抗和α-平滑肌肌动蛋白一抗(Abcam公司,批号:ab32575、ab92547),HE染色试剂(上海舜田生物科技有限公司,批号:SBT10001),Masson染色试剂(北京索莱宝科技有限公司,批号:G1340),辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(湖北鸿鑫瑞宇精细化工有限公司,批号:275-632-5),GAPDH 抗体(Proteintech Group,Inc.,批号:ELK8632)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及建模方法:按随机数字表法将小鼠分为空白组、模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组18只。除空白组外,其余4组均通过一次性腹腔注射40 μmol/L百草枯(18 mg/kg)建立肺纤维化模型[7]。给予空白组小鼠腹腔注射等量无菌生理盐水。

1.3.2 地龙提取物的提取方法及小鼠的干预方法:(1)地龙提取物的提取。将地龙干燥饮片剪碎并用乙醇回流提取2次,过滤回收后浓缩,并溶于5 mL生理盐水备用。(2)小鼠的干预方法。建模后1周,分别给予高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠灌服80 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)地龙提取物,1次/d,干预14 d。给予空白组和模型组小鼠灌服等量的生理盐水。

1.3.3 Western blot检测波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的相对表达水平:以小鼠建模当天记为第0天,分别于建模后第14天、第21天和第28天,采集各组小鼠右肺组织,采用Western blot检测波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白相对表达水平。于每个时间点,每组选取6只小鼠,采用脱颈椎法处死,解剖小鼠后分离其新鲜右肺组织并称重,冰上研磨后,采用RIPA细胞裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,利用二喹啉甲酸法检测细胞蛋白浓度。取95 ℃高温变性后的150 μg蛋白,通过SDS-PAGE分离等量蛋白,将蛋白转至PVDF膜。使用5%脱脂牛奶在4 ℃下封闭PVDF膜1 h,用TBST洗膜3次,5 min/次,然后加入波形蛋白一抗(1 ∶500)、α-平滑肌肌动蛋白一抗(1 ∶500)及GAPDH一抗(1 ∶2 000),4 ℃湿盒孵育过夜,TBST洗膜3次,5 min/次,再将膜置于辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(1 ∶3 000)中,室温孵育1 h,TBST洗膜5次,5 min/次。以GAPDH为内参蛋白,显影曝光后,利用Image-Pro Plus图像分析软件分析蛋白条带的灰度值[8]。

1.3.4 肺组织HE染色及Masson染色:建模第21天,采用脱颈椎法处死小鼠,用灭菌生理盐水进行心脏灌流后,取左上肺组织,将其固定于4%的多聚甲醛,经石蜡包埋、切片后,进行HE染色和Masson染色,严格按照试剂说明进行操作。其中HE 染色的切片用于评估肺组织纤维化情况,Masson染色的切片用于观察肺组织胶原沉积情况[9]。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同时间点各组小鼠肺组织波形蛋白表达水平的比较 建模后第14天,模型组及各剂量组小鼠肺组织的波形蛋白表达水平均高于空白组(均P<0.05)。建模后第21天及第28天,模型组小鼠肺组织的波形蛋白表达水平均高于空白组,高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠肺组织的波形蛋白表达水平均低于模型组(均P<0.05)。建模后第28天,高剂量组小鼠肺组织的波形蛋白表达水平低于低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 不同时间点各组小鼠肺组织波形蛋白相对表达水平的比较(x±s)

2.2 不同时间点各组小鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白表达水平的比较 建模后第14天,模型组和各剂量组小鼠肺组织的α-平滑肌肌动蛋白表达水平均高于空白组(均P<0.05)。建模后第21天及第28天,模型组小鼠肺组织的α-平滑肌肌动蛋白表达水平均高于空白组,高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠肺组织的α-平滑肌肌动蛋白表达水平均低于模型组(均P<0.05)。建模后第28天,高剂量组小鼠肺组织的α-平滑肌肌动蛋白表达水平均低于中剂量组与低剂量组(均P<0.05)。见表2。

表2 不同时间点各组小鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白相对表达水平的比较(x±s)

2.3 各组小鼠肺组织HE染色结果 建模第21天时,空白组小鼠肺组织结构完整,肺泡清晰,未见肺泡间隔明显增厚等纤维化表现;模型组小鼠肺组织结构异常,正常肺泡结构消失,肺泡壁明显增厚,成纤维细胞增生明显;相较于模型组,高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠的肺纤维化程度明显减轻,肺泡结构相对完整,且地龙提取物浓度越高,小鼠肺组织结构越完整,纤维化程度越轻。见图1。

空白组 模型组 高剂量组 中剂量组 低剂量组

2.4 各组小鼠肺组织Masson染色结果 建模第21天时,空白组小鼠肺泡结构完整,少见蓝色的胶原纤维沉淀;模型组小鼠肺泡间隔和间质均存在大量蓝色沉淀,肺泡结构异常;相较于模型组,高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠肺泡间隔和间质的蓝色沉淀明显减少,肺泡结构相对完整,且地龙提取物浓度越高,上述改善越明显。见图2。

空白组 模型组 高剂量组 中剂量组 低剂量组

3 讨 论

目前,肺纤维化的发病机制尚未完全清楚,其病理过程主要为肺间质细胞增生和细胞外基质沉积,导致肌成纤维细胞大量形成,进而引起呼吸困难和肺功能衰竭[10]。研究表明,肺纤维化的发生与炎症、上皮-间质转化、肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞等有关,而且多种细胞因子参与其中[11]。波形蛋白是细胞骨架蛋白,正常情况下在间叶组织中表达,其表达水平与肺纤维化程度呈正相关,可作为反映肺纤维化进程的标志物[12]。α-平滑肌肌动蛋白是肌成纤维细胞的标志物及平滑肌细胞收缩的结构基础,其具有较强的收缩能力及促进胶原合成能力,能促进胶原沉积并形成纤维化,其表达水平与肺纤维化程度呈正相关[13]。

肺纤维化属于中医的“络病”范畴,由肺络瘀阻所致,因此中医认为消除络脉之瘀浊、保持脉(经)络气血通畅和肺络无损是治疗肺纤维化及肺系脉络病的关键[14]。地龙是较早被应用的动物类药物之一,其由蚯蚓去除杂质、炒制干燥制成,味咸、寒,归肝、脾、膀胱经,具有清热定痉、通络、平喘、利尿的功效,在治疗肺纤维化的多个中医方剂中均有地龙[15]。有研究表明,地龙能下调肝脏细胞α-平滑肌肌动蛋白表达水平,改善小鼠肺纤维化程度[16],但其最佳的干预剂量目前仍有争议。本研究采用百草枯建立肺纤维化小鼠模型,结果显示,模型组小鼠肺组织结构异常,正常肺泡结构消失,肺泡壁明显增厚,成纤维细胞增生明显,且建模后第14天,模型组小鼠肺组织的波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达水平均高于空白组(均P<0.05)。这说明肺纤维化小鼠模型建模成功。本研究结果还显示,建模后第21天起,高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠肺组织的波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达水平均低于模型组(均P<0.05);建模后第28天,高剂量组小鼠肺组织的波形蛋白表达水平低于低剂量组,α-平滑肌肌动蛋白表达水平均低于中剂量与低剂量组(均P<0.05)。这提示地龙提取物可以抑制肺纤维化模型小鼠肺组织波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达,且高剂量地龙提取物的效果更佳。HE染色和Masson染色结果显示,高剂量组、中剂量组和低剂量组小鼠在肺组织结构及胶原纤维沉淀等方面的改善程度均优于模型组,且地龙提取物浓度越高,改善程度越明显,表明地龙提取物能够有效保护肺纤维化模型小鼠肺组织结构,减轻纤维化及胶原沉积,以高剂量地龙提取物效果最佳。

综上所述,地龙提取物能有效抑制肺纤维化小鼠肺组织中波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达,减少肺组织胶原沉积,延缓肺纤维化的进程,其中高剂量[80 mg/(kg·d)]地龙提取物的效果最佳。但本研究例数较少,可能对结果产生影响,故所得结论仍需进一步研究加以证实。