铁死亡通路中ACSL4、LPCAT3蛋白表达在特发性炎性肌病中的研究

王虎年，柴克霞，张莉

1.青海大学医学部，青海西宁 810001；2.青海大学附属医院风湿免疫科，青海西宁 810001

铁死亡（ferroptosis）最早发现于2003年，相关研究学者将其定义为一种基于铁依赖性脂质过氧化反应后的不可逆死亡模式[1]。2021年，学者Dixon正式将其命名为铁死亡[2]。作为一种调节性细胞坏死方式，其具有不同于以往任何一种细胞死亡的方式。在损伤机制上，主要为细胞中脂质氧化产物的不断积累，超过自身的清除能力后破坏细胞膜结构，造成不可修复的损伤，最终导致细胞死亡。

1 铁代谢

研究表明，植物中的非血红素Fe3+与动物中的血红素Fe2+[3]，均能够被人体吸收后转化为铁元素。铁和铁的衍生物在参与细胞代谢过程中，如果含量超过正常范围会引发Fe2+过多地参与芬顿反应，衍生大量羟基自由基，进而引发细胞内过氧化物聚积过多，抑制铁的活性或诱发铁死亡。

1.1 铁的吸收与转运

非血红素Fe3+在与细胞色素B接触之后，两者会产生还原反应生成大量Fe2+，随后在二价金属离子转运体1（divalent metal transporter 1, DMT1）的辅助下，Fe2+进入小肠上皮细胞（intestinal epithelial cell, IEC），借助IEC 的吸收使血红素Fe2+逐渐被机体转化为细胞铁。另一方面，细胞外部的Fe3+和转铁蛋白（transferrin, TF）具有极高的相溶性，独立的TF分子能够同时驱使两个Fe3+朝铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TFR1）表面迁移，最终衍生出TF-[Fe3+]2-TFR1复合物[4]，其能够快速到达细胞内部，通过与细胞溶酶体反应，在溶酶体酸性环境中，生成大量作用于活性铁还原酶STEAP3的Fe3+，STEAP3在细胞质中通过催化还原反应生成Fe2+。过多的Fe2+，不断参与芬顿反应，同时产生过量的过氧化物。并且被细胞膜上铁转运蛋白氧化转变为Fe3+，最终被迁移至细胞外侧[5]。

1.2 铁代谢失衡

疾病发生时，TF与胞膜上的TFR1结合增加，造成细胞内的铁离子负载增加[6]，游离铁能够加大芬顿反应和过氧化氢反应，催化生成大量羟基自由基和活性氧（reactive oxygen species, ROS），其可进一步攻击细胞膜与蛋白质结构、DNA结构，引发细胞初始结构变化和细胞功能变化。

2 脂质代谢

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）划分为ω-3类与ω-6类[7]。其中ω-3类PUFAs对人体具有较大益处，如：花生四烯酸（arachidonic acid, AA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）等。

2.1 脂质代谢的脂酰辅酶A合成酶家族

从化学性质上看，脂肪酸并不活跃，只有ATP、辅酶A 、镁离子等较为充足的情况下，内质网与线粒体外膜中的脂酰辅酶A合成酶（acyl-CoA synthetases, ACSL）才能对脂肪酸产生催化作用，使之转化为能够在特定通路代谢的脂酰辅酶A，从催化脂肪酸碳链长度上看，ACSL具有长链、中链、短链3种类型，例如长链脂酰辅酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase 4, ACSL4）。在ACSL家族中，能够被其催化的脂肪酸碳链数量介于12～20个[8]。与之相关的研究结果证实，机体中的脂肪酸代谢过程离不开ACSL家族的参与，而ACSL家族的核心作用就是提供脂肪酸代谢[9]。在哺乳动物中，ACSL的同工酶主要有ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6共5个种类。虽然所有亚型催化过程与酶促反应具有较高的相似性，但酶动力学特征、反应物质、亚细胞定位存在较大差异，因此每种亚型引导脂肪酸走向特定的代谢通路，由此所引起的疾病也是不同的。心脏和脂肪组织，以及骨骼肌中的ACSL1表达水平最高[10]，胚胎发育阶段的ACSL3表达水平最高，类固醇生成组织中的ACSL4含量较多，且分布较为均匀，小肠是ACSL5的重要聚积场所，ACSL6只能在大脑中得到表达。在亚细胞定位方面，ACSL4则是以过氧化物酶体与线粒体相关联的内质网膜为定位，在铁死亡中与溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase3, LPCAT3）构成脂质代谢的关键蛋白。

2.2 铁死亡中的ACSL4、LPCAT3通路蛋白

PUFAs作为细胞膜磷脂双分子层不可缺少的重要成分，是细胞膜流动过程的重要作用物质。磷脂在含有大量PUFAs的情况下，极有可能转化为加速细胞的铁死亡的过氧化脂质。因此，PUFAs含量与定位是决定细胞内脂质过氧化程度和铁死亡程度的两大要素。脂质过氧化主要是氧化剂由初始PUFAs中的二烯丙基亚甲基群中俘获稳定性较差的氢原子，在过氧化作用下形成脂质过氧化自由基和脂质过氧化氢[11]。脂质的代谢过程主要经历了两个阶段：①多不饱和脂肪酸的磷脂（polyunsaturated fattyacid-phosphatidyl ethanolamine,PUFA-PE）合成阶段，游离PUFAs在该阶段主要负责为合成脂质信号传导递质提供底物。②过氧化阶段，该阶段会产生酯化膜磷脂，如果膜磷脂未形成或未发生过氧化反应，就无法产生铁死亡信号。大量脂质组学研究证实，DHA和EPA等为ACSL4更偏好利用的PUFAs，其在ACSL4的作用下会酰基化反应为PUFA-CoA，然后通过溶血磷脂酰胆碱酰基与LPCAT3结合，催化形成酯化物，随后不断和细胞中的磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine, PE）产生反应，生成大量PUFA-PE，同时LPCAT3会持续不断的将PUFA-PE转移至细胞膜上，使两者不断的融合内化，PUFA-PE此时的过氧化定位于质膜和内质网。随着细胞内PUFA-PE不断地产生与积累，脂质过氧化步骤启动。具体来说，过氧化反应有两种形式，一种是无酶参与的脂质过氧化；另一种是有酶参与的脂质过氧化。其中，没有酶参与的脂质过氧化实际上是脂质自身的氧化反应。细胞中聚集的Fe2+超过临界状态时，会产生过芬顿反应持续释放大量羟基自由基，PUFAs会持续氧化反应为脂质过氧化氢。同时，生成的所有基团均能够在连锁反应过程中诱导PUFAs的氧化过程，生成大量脂质过氧化物。在酶参与的脂质过氧化中，脂氧合酶为脂质过氧化的催化物，PUFAs首先生成多种类型的脂质过氧化氢，然后经过Fe2+的催化转变为脂质过氧化链式反应催化物—烷氧基自由基[12]。脂质过氧化能够生成一些对细胞活性具有毒害作用的物质，一旦这些物质超出代谢范围，就会造成生理功能蛋白活性下降，诱发铁死亡。氧化反应持续过程中，PUFAs会逐渐耗竭，原有细胞膜的流动性结构随之发生较大变化，膜的通透性会增强，从而加速细胞死亡。需要指出的是，在Fe2+过量的情况下，Fe2+不仅会参与自由基形成过程，也会对脂质过氧化反应起到积极的催化作用。由此可见ACSL4和LPCAT3在铁死亡发生过程中发挥关键作用，由此可以确定，如果给予相应抑制剂降低ACSL4、LPCAT3的生成量，即可减少铁死亡发生率，这对相关疾病的治疗具有重大意义。

3 氨基酸代谢

哺乳动物细胞膜上的胱氨酸-谷氨酸交换转运体Sys-temXc-集中度较高，其结构为轻链亚基和重链亚基组成，二硫键在其中发挥着重要的链接作用[13]。Sys-temXc-可促进细胞中的谷氨酸向细胞外部转移，让细胞外的胱氨酸向细胞内部转移，从而生成能够辅助谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成的半胱氨酸。GSH在细胞内部主要起到抗脂质氧化作用，能够拮抗铁死亡过程。因此，细胞抗脂质氧化能力强弱可根据半胱氨酸丰度大小进行判定。在细胞内部Sys-temXc-系统活跃度不高时，细胞依然能够在转硫途径的引导下合成半胱氨酸。GSH能够加强细胞的氧化抗性，避免出现氧化物质在细胞内过度积累。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase4, GPX4）是由大量硒蛋白成分组成，可通过GSH辅助因子进行活性调节。一些研究结果证实GPX4的合成过程需要Sys-temXc-参与。GPX4对于铁死亡过程具有积极的调节作用，能够通过脂质修复酶和GSH的反应物质脂质过氧化氢生成不具备细胞毒性的脂质醇，使氢过氧化物产生量减少，从而抑制脂质过氧化链式反应过程，降低铁死亡发生率。简而言之，GPX4能够使脂质过氧化产生的物质还原为脂质醇，减少脂质过氧化程度。Zhao Y等[14]通过研究发现肿瘤组织中的GPX4表达水平显著高于正常组织，肿瘤患者的GPX4表达水平越高，预后效果越差。同时，他还采用能够对铁死亡起到诱导作用的RSL3诱导GPX4表达，发现RSL3不仅抑制了GPX4表达能力，还显著提高了化疗药物对肿瘤组织的治疗效果，即化疗能明显改善化疗药物的抗肿瘤作用。另外有相关研究表明，Erastin能够抑制Sys-temXc-的生物学活性，诱导细胞发生铁死亡[15]。

4 3条途径的相互联系

正常新陈代谢中，细胞会自然代谢出脂质氢过氧化物[16]，而GPX4能够将其还原为脂质醇，降低细胞过氧化程度，保护细胞活性。在细胞铁数量过多且脂质代谢功能异常的情况下，脂质氢过氧化物数量将显著增加，导致GPX4快速耗竭。过量脂质氢过氧化物能够在Fe2+介导后通过芬顿反应转化为脂质自由基，通过与PUFAs反应，加强脂质过氧化程度，使原有的细胞膜理化性质发生突变，细胞膜厚度减小，细胞外氧化剂对细胞渗透能力增强，细胞内的代谢状态随之改变，大量脂质自由基沉淀在细胞内部，直至过氧化的下游的毒性产物在生化通路中的数量不断增加，细胞氧化失去平衡，造成细胞铁死亡。

5 皮肌炎的铁死亡抑制胰岛素/Akt信号通路

在正常的新陈代谢中，胰岛β细胞会自动分泌大量能够在血管通路中流动的胰岛素，一旦胰岛素达到骨骼肌组织便会与细胞膜胰岛素受体α亚基结合起来，激活β亚基蛋白酪氨酸激酶，磷酸化胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1,IRS-1）。IRS-1在活跃状态下能够持续向磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）传输刺激信号[17]，而PI3K则会通过下游信号转导通路刺激磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B, PKBAkt），使之进入活跃状态[14]。Akt在激活之后能够对叉头框蛋白O3转录因子（forkhead box O3, FoxO3）起到抑制作用，从而实现以FoxO3表达为引导的肌肉特异E3泛素连接酶Atrogin-1/MAFbx产生过程和自噬介质Binp3表达过程起到调节作用。由于上调Atrogin-1/MAFbx表达水平能够激活泛素-蛋白酶体系统功能，促使骨骼肌蛋白分解速度加快；如果Binp3表达能力得到增强，自噬溶酶体通路将被激活，自噬过程将会加速进行。因此，激活维持胰岛素/Akt信号通路不仅能够抑制骨骼肌细胞内蛋白异常分解过程，还能够显著改善骨骼肌细胞的生存环境。在分泌量非常有限或毒性产物较多的情况下，胰岛素/Akt信号通路将被抑制，胰岛素对机体的作用显著减弱，骨骼肌细胞会自动关闭当前的下游信号通路，激活泛素-蛋白酶体系统和自噬溶酶体途径[18]，使骨骼肌细胞蛋白发生非正常分解。相关研究证明，在与肠内分泌细胞膜GPR120结合过程中，能够参与其中的PUFAs只有EPA和DHA，两者的参与会加速分泌胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）的过程，引发肠促胰岛素效应。此外，在使固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）表达能力受到抑制后，EPA与DHA可通过优化机体内部的脂质代谢环境加快胰岛素分泌过程。然而特发性炎性肌病（idiopathic inflammatory myopathy, IIM）的铁死亡发生时，EPA与DHA作为游离的PUFAs，在ACSL4、LPCAT3的作用下，不断被消耗，并产生了脂质过氧化，即在EPA与DHA被消耗不能发挥肠促胰岛素效应等情况下；且其在铁死亡通路上进一步氧化产生了有害物质，抑制胰岛素/Akt信号通路的活性，激活了泛素-蛋白酶体与自噬溶酶体通路，加剧了IIM发生时骨骼肌蛋白的分解，这两种现象在判断IIM发病中骨骼肌组织萎缩症状和萎缩是否持续发展方面具有重要参考价值。

6 总结与展望

铁死亡在最近几年的研究中关注程度不断提高，其发生后会出现两种现象，一种是细胞内游离铁增多，另一种是脂质过氧化物含量超标。铁死亡在多种疾病的发病中起到重要作用，有着复杂的网状结构，其中铁代谢，脂质代谢，氨基酸代谢为最重要的三条通路，相互影响，共同促进铁死亡的发生。大量证据表明铁死亡将有望成为免疫系统疾病治疗新的研究方向。