卡格列净对糖尿病肾病的保护作用及对TGF-β1和CTGF表达的影响

曹冰 张静 陆晨

糖尿病肾病(diabetic kidney disease)是糖尿病患者严重的微血管并发症之一,也是目前导致终末期肾病发生的主要原因之一。目前治疗糖尿病肾病的最佳治疗措施包括严格控制血糖、血压及降低尿蛋白的排泄,虽然该病的治疗方案选择性很多,但这并没有使糖尿病肾病发病率降低。钠葡萄糖共转运体2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制剂是一种新型的糖尿病治疗药物,研究表明SGLT2抑制剂具有降糖、降压、降低蛋白尿排泄、改善肾纤维化等肾脏保护作用[1]。研究证实,转化生长因子β1(transforming grouth factor beta 1,TGF-β1)合成增加的许多原因是由于高血糖的作用,TGF-β1可导致基底膜增厚、系膜基质增生及肾小球结节性硬化的发生,促进肾脏纤维化发生,与此同时,结缔组织生长因子(connective tissue grouth factor,CTGF)也是一种新的促进纤维化生长因子,它的表达在一定程度上受到TGF-β1的调节,在糖尿病肾病的组织中表达量增加,参与致肾脏纤维化的作用中。有研究表明SGLT2抑制剂可通过抑制糖尿病大鼠肾脏 TGF-β1的水平对大鼠的肾脏存在保护作用[1]。卡格列净为目前临床应用的SGLT2抑制剂之一,本实验通过建立对照组、糖尿病肾病组、卡格列净干预组3种大鼠模型,分别给予蒸馏水及卡格列净药物干预,观察大鼠血糖变化、尿蛋白变化情况,同时评价卡格列净对糖尿病肾病的保护作用机制及对TGF-B1及下游因子CTGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由新疆医科大学第一附属医院动物饲养中心提供SPF级雄性 Wistar 大鼠共28只,于新疆医科大学动物实验中心进行繁育。选8～10周龄,体重200～250 g进行饲养。饲养温度(23±3)℃,相对湿度40%～70%。该研究通过新疆医科大学实验动物伦理委员会审批,伦理审批号:IACUC-20210425-14。

1.2 主要试剂 (1)45%高脂饲料(日粮型,大鼠)、普通饲料(对照组)(江苏协同公司);(2)链脲菌素(sigma公司);(3)卡格列净片(规格100 mg,生产企业:Janssen-CilagS.p.A.意大利);(4)RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(博士德公司);(5)山羊抗兔IgG H&L (HRP)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司);(6)Rabbit Anti-TGF beta 1 antibody、Rabbit Anti-CTGF antibody等(博奥森公司)。

1.3 主要仪器 手动单道移液器(德国Eppendorf公司 Research plus);罗氏(ROCHE)血糖仪家用血糖试纸(罗氏卓越型);电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司DNP-9272);酶标仪(美国Bio-Rad xMarkTM);高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司);漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);微量分光光度计(杭州奥盛Nano-100;BG-Power600i);常规电泳仪电源(北京百晶生物技术有限公司BG-Power600i);电泳仪(北京六一DYCZ-21);Real Time PCR instrument(美国ABI 7500 Fast);化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司 Chemiscope 3000);蛋白转膜仪[Bio-Rad(USA) Mini-PROTEAN Tetra system]。

1.4 方法

1.4.1 实验分组:将28只雄性SD大鼠适应性喂养1周后,随机数字表法随机分为:对照组(8只);糖尿病肾病组(10只);卡格列净干预组(10只)。

1.4.2 糖尿病肾病大鼠模型造模过程:大鼠普通饲料适应性喂养1周后,继续给予高脂高糖饲料喂养4周(对照组大鼠给予普通饲料喂养4周),第5周第1天糖尿病肾病组和卡格列干预组大鼠腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg(pH值4.45、0.01 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)1次,对照组大鼠注射等体积溶剂。注射第3天测随机血糖1次,随机血糖<11.1 mmo/L的大鼠,需重新注射1次STZ(50 mg/kg),7 d后,连续3 d尾静脉取血,随机血糖≥16.7 mmo/L,若大鼠出现多饮、多食、多尿、体重下降的典型的“三多一少”症状,以及尿检白蛋白升高、毛发枯黄、精神萎靡、反应迟钝等现象则证明造模成功。次日开始卡格列净干预组给予卡格列净 (10 mg/kg)灌胃,对照组及糖尿病肾病组给予蒸馏水(等体积)灌胃,持续灌胃37 d后处死大鼠。

1.4.3 标本的收集与处理:①血清样本收集:大鼠处死以后,收集腹腔动脉血>1～2 ml,分离血清,保存于-80℃冰箱中,为检测空腹血糖,大鼠处死12 h之前禁食;②组织样本收集:大鼠处死后,收集肾脏组织,称重完以后,在液氮速冻后,-80℃冻存,用于Westerm blot和RT-PCR检测。

1.4.4 qRT-PCR检测肾脏组织中TGF-β1、CTGF基因表达水平:取肾脏组织提取RNA,进行qRT-PCR检测TGF-β1、CTGF基因表达水平。

1.4.4.1 RNA提取步骤:将组织在液氮包围的情况下,研磨成粉,取100 mg加入有1 ml TRLZOL的离心管中,混匀。室温放置>15 min。加入200 μl的氯仿,颠倒混匀后室温放置5 min。4℃下12 000 r/mim离心15 min。吸取上清至另一个新的离心管中,加入等体积的异丙醇混匀,-20℃放置60 min。4℃下12 000 r/min离心15 min,小心倒掉上清液。加入75%的乙醇,使沉淀漂浮起来洗涤。4℃ 12 000 r/min离心15 min,小心倒掉上清液。重复上述步骤1次。空管离心,吸尽液体。用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量仪检测RNA浓度,琼脂糖电泳检测RNA完整性。RNA反转录用于后续实验。

1.4.4.2 第一链cDNA合成。

1.4.4.3 荧光定量实验:荧光定量PCR体系包含:Eva Green 2×qPCR MasterMix 10 μl、cDNA 1 μl、RNase-free Water Up to 20 μl,上下游引物各0.6 μl。荧光定量引物信息:Tgfb1-F:5’-CTGCTGACCCCCACTGATAC-3’,Tgfb1-R:5’-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3’,CTGF-F:5’-CCCAACTATGATGCGAGCCA-3’,CTGF-R:5’-CATTGGTAACC CGGGTGGAG-3’,rat GAPDH_F:5’-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3’,rat GAPDH_R:5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’。反应条件:95℃ 10 min 预变性;95℃ 15 s 变性; 60℃ 60 s 退火并延伸;循环40 次。

1.4.5 Westerm blot检测肾脏组织中TGF-β1、CTGF蛋白表达水平:取肾脏组织提取蛋白,Western blot检测TGF-β1、CTGF蛋白表达水平。

2 结果

2.1 3组大鼠血糖情况 糖尿病肾病组及卡格列净干预组的大鼠血糖监测水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),卡格列净干预组在给药第18天后血糖水平明显低于糖尿病肾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠血糖情况 mmol/L,

2.2 3组大鼠尿液中蛋白情况 注射STZ第2、3天,糖尿病肾病组及卡格列净干预组尿液中的蛋白含量均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);处死前糖尿病肾病组的尿蛋白定量水平明显高于对照组(P<0.05),卡格列净干预组明显低于糖尿病肾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠尿液中蛋白含量情况 mg/L,

2.3 3组大鼠组织中各基因表达情况 糖尿病肾病组及卡格列净干预组的TGF-β1及CTGF的基因表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),卡格列净干预组的TGF-β1及CTGF的基因表达水平明显低于糖尿病肾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠组织中各基因表达情况

2.4 3组大鼠肾脏组织各蛋白表达水平情况 糖尿病肾病组及卡格列净干预组大鼠肾脏组织中的TGF-β1及CTGF蛋白表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),卡格列净干预组大鼠肾脏组织中的TGF-β1及CTGF蛋白表达水平明显低于糖尿病肾病组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4,图1。

图1 Western blot印迹检测不同因子在3组中表达水平

表4 3组大鼠肾脏组织各蛋白表达水平情况

3 讨论

糖尿病肾病是目前导致终末期肾病发生发展的主要原因之一,大约25%的糖尿病患者会出现持续性蛋白尿和(或)肾小球滤过率持续性下降[2]。肾间质纤维化的严重程度是反映糖尿病肾病患者肾功能下降程度和预后判断的一项重要指标,也是DKD及其他慢性肾脏疾病进展为终末期肾病的共同致病机制[3]。持续高血糖的存在可以导致糖基化中间产物堆积以及脂蛋白代谢异常,使肾脏血流动力学发生变化,最终导致糖尿病肾病的发生[4]。既往研究证实,高血糖参与调解TGF-β1的合成,导致基底膜增厚、系膜基质增生及肾小球结节性硬化的发生,成为糖尿病肾病发病的基础[5]。

SGLT2抑制剂是一类新型降糖药物,它通过抑制 SGLT2的转运作用从而使肾脏对葡萄糖重吸收减少,促进尿糖、尿钠的排出,为降低糖尿病肾病早期高滤过提供了基础[6]。SGLT2抑制剂不刺激胰岛素分泌,低血糖的发生风险极低,许多研究均证实了该药物的有效性及安全性[7]。研究显示SGLT2抑制剂除了能有效降低血糖及HbA1c外,对心血管疾病的其他危险因素包括体重、血压、血脂、血尿酸、高胰岛素血症、动脉硬化及氧化应激均有保护性调节作用,同时可使尿蛋白水平下降[8],以上均提示 SGLT2抑制剂对DKD具有直接或者间接的肾脏保护作用。本实验建立了对照组、糖尿病肾病组、卡格列净干预组3种大鼠模型,分别给予蒸馏水及卡格列净药物干预,观察大鼠血糖变化、尿蛋白变化情况,同时评价SGLT2抑制剂对糖尿病肾病的保护作用机制及对TGF-B1及其下游因子CTGF表达的影响。

本研究结果显示,卡格列净干预组在给药第18天后血糖水平明显低于糖尿病肾病组(P<0.05),提示卡格列净具有较好的降糖作用。糖尿病肾病组、卡格列净干预组尿液中的蛋白含量均明显高于对照组(P<0.05),卡格列净干预组在处死前的尿蛋白定量水平明显低于糖尿病肾病组(P<0.05),提示卡格列净可降低大鼠的尿蛋白水平,起到一定程度的肾脏保护作用。

除此之外,本研究结果显示糖尿病肾病组、卡格列净干预组的TGF-β1及CTGF的基因表达水平、大鼠肾脏组织中的TGF-β1及CTGF蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05),卡格列净干预组的TGF-β1及CTGF的基因表达水平、大鼠肾脏组织中的TGF-β1及CTGF蛋白表达水平明显低于糖尿病肾病组(P<0.05)。卡格列净药物干预治疗后TGF-β1和CTGF水平较糖尿病肾病组明显下降,提示SGLT2抑制剂可能通过抑制TGF-β1及其下游的CTGF途径发挥抗纤维化作用,进一步保护肾脏功能。相关研究表明,转化生长因子-β(TGF-β1)是一种多肽类调控蛋白,它调节细胞的增殖和分化主要是通过受体信号通路的传递,从而增加其细胞外基质的含量,加重肾小球硬化的进展[9]。TGF-β1可刺激肾脏细胞增殖与分化,并刺激肾脏多种细胞外基质成分的合成,同时也参与抑制细胞外基质的降解过程中[10]。在糖尿病肾病的发生发展过程中CTGF也是一种新的促进纤维化生长因子,广泛存在于肾脏组织中,它通过增加细胞外基质导致基质沉积、调解细胞外基质的代谢周期、促进上皮细胞转型等多种机制促进肾脏发生纤维化[11],它的表达在一定程度上受到TGF-β1的作用调解,CTGF也在糖尿病肾病的组织中表达量增加,参与致肾脏纤维化的作用中[12]。本研究结果显示SGLT2抑制剂通过降低TGF-β1及其下游因子CTGF的表达水平,减轻肾脏纤维化,进一步达到肾脏保护作用。

综上所述,SGLT2抑制剂通过降低TGF-β1及其下游因子CTGF的表达水平,发挥糖尿病肾病保护作用。本研究结果为糖尿病肾病的防治提供了新的靶点药物,为SGLT2抑制剂的肾脏保护作用提供了更多理论依据。