白介素6在甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶治疗大鼠牙周炎中的变化

陈东 王立津

与牙周炎症关系密切的主要细胞因子中,白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)参与并促进了牙周组织特别是牙槽骨的一系列破坏活动。有研究发现,IL-6不仅可以通过作用破骨细胞前体刺激破骨细胞的形成,还可以通过刺激成骨细胞系表达RANKL,进而促进破骨细胞生成,其中相关机制为IL-6通过激活Janus 激酶 2(janus kinase 2,JAK2)和人核因子KB受体活化因子配体(human nuclear factor KB receptor activator ligand,RANKL)信号通路来介导并增加破骨细胞分化[1]。临床调查发现,唾液中的IL-6水平与C-反应蛋白、牙齿数量、临床附着丧失(CAL)、牙周袋深度(PPD)和出血部位(FMB)呈负相关;而牙周炎患者的唾液IL-6水平与口腔牙齿数量呈负相关,直接与牙周炎的患病范围呈正比例相关[2]。动物实验发现,阻断IL-6受体(IL-6R)就可以抑制减少IL-6介导的促炎活性导致的牙槽骨吸收和附着丧失[3]。国外报道壳聚糖阿托伐他汀凝胶在体外细胞模型研究中可以降低IL-6的表达水平[4],在大鼠牙周炎模型的结果与体外细胞模型结果一致[5]。国内也开展过羧甲基壳聚糖与IL-6表达的体外细胞模型研究[6]。作者前期开展了有关甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶(metronidazole carboxymethyl chitosan topical gel,M/CMCS)对大鼠牙周炎模型破骨细胞和前列腺素E2影响的研究,发现试药能够减轻大鼠牙周炎症、减少骨吸收、促进愈合[7]。本研究考察M/CMCS治疗大鼠牙周炎模型过程中IL-6的相关表达变化情况。依照本文作者的前次相关研究方法[7,8],适当予以改进。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与耗材 麻醉剂2%戊巴比妥钠;Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)(上海碧云天生物技术有限公司);大鼠IL-6 ELISA试剂盒和IL-6免疫组化检测试剂盒(均为武汉爱博泰克生物科技有限公司产品)。

1.2 试验药物 参照本实验室前次办法,自制甲硝唑羧甲基壳聚糖复方温敏凝(含0.75%甲硝唑和20%羧甲基壳聚糖)[8];0.75%甲硝唑凝胶(湖北康正药业有限公司)和2%盐酸米诺环素软膏(日本Sunstar株式会社,商品名:PERIO®,均商业采购。

1.3 动物建模与分组 动物模型建立参照本组前次方法进行[7,8]。SPF级75只,8周龄,体重(275±25)g,健康雄性SD大鼠,购自华北理工大学医学动物实验中心。动物常规适应性饲养1周,在2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后,在大鼠双侧上颌第一磨牙龈缘处腭侧打结结扎结扎丝,然后1次/d,连续3次密度为1×109CFU/ml的200 μl的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)牙周接种,给与10%葡萄糖饮水。造模后每周检查1次,第6周结束前检查牙周情况,并随机抽取3只大鼠施行安乐死,X线片和HE病理学检查评估。模型成功判定参照文献与作者过去的造模标准[9,10]。结果显示模型全部成功。然后将剩下72只大鼠随机分为4大组,每组18只。MODEL组:阳性模型对照组,上颌第一磨牙龈缘处和牙周袋不涂布任何药物;M/CMCS组:涂布自制的甲硝唑羧甲基壳聚糖温敏凝胶;PERIO组:涂布2%盐酸米诺环素软膏;MNZ组:涂布0.75%甲硝唑凝胶。局部早晚各涂药1次,持续至各组动物在相应时间点,即涂药开始后满1周(第8天),满3周(第22天)和满5周(第36天),各组分别随机抽取6只大鼠,麻醉状态下采集全血,然后实施安乐死,分离截取上颌骨。一侧上颌骨组织块供ELISA实验,后续处理方法见1.4.3;对侧上颌骨供免疫组化实验,具体方法见1.5 的IL-6免疫组织化学实验部分。

1.4 ELISA法检测组织样本的IL-6浓度

1.4.1 龈沟液测试样本制备:在治疗开始期满的第1、3、5周计划时间点,依既往办法采集每组抽取的6只大鼠龈沟液[7]。

1.4.2 全血测试样品制备:各时间点、每组采集龈沟液结束后的6只大鼠,麻醉状态下无菌切开腹腔,在脊柱下段旁侧用负压抗凝管穿刺采取腹主动脉血5 ml,低温离心5 min,取上清液放-80℃冰箱冻存、待测。

1.4.3 上颌骨牙周软、硬组织取材与标本制备:全血采集后,脊椎脱臼法处死大鼠,剥离完整上颌骨及附带牙周软组织,上颌骨截断左右2段,分为2组。一侧颌骨放入4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液中固定,制作石蜡切片供IL-6免疫组织化学实验。另一侧颌骨,在拔牙后分离牙槽窝周边厚约2 mm范围软组织(每样本≥50 mg),置无菌冻存管液氮冷冻;牙槽骨每样本≥30 mg标记后也立即液氮冷冻,供裂解蛋白提取。

1.4.4 牙周组织与牙槽骨总蛋白提取:分别取出称重的软组织和牙槽骨冻存管,置液氮钵中2 min内快速加液氮、磨成细粉末。粉末入离心管后按照20 mg组织配200 μl的比例加入Western及IP细胞裂解液混匀,冰浴、低温离心得上清液,转移上清液即分别得到牙周和骨组织总蛋白提取物,分装标记后-80℃冰箱保存。

1.4.5 ELISA法分析IL-6浓度:分别取前述制备冻存的大鼠龈沟液、全血、牙周组织与牙槽骨总蛋白提取上清液标本,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测标本中IL-6的含量。严格遵照ELISA试剂盒说明书操作,终止反应后以酶标仪450 nm波长处空白对照孔调零后,测各孔OD值,标准曲线求方程式,计算浓度。

1.5 免疫组化实验检测IL-6表达 前述1.3处固定的颌骨组织块,常规脱钙脱水包埋制作石蜡块,沿上颌骨长轴作矢状连续5 μm切片,取最佳取材位点基本相同位置制备切片备用。按照大鼠白介素IL-6免疫组化检测试剂盒说明书操作。脱水后封片。先用4 X光镜观察,然后换400 X采集图像进行定量分析,每张切片中各选取5个面积相同的视野拍摄图片Image-Pro Plus6.0图像分析系统处理,计算平均光密度值(mean optical density,MOD)。

2 结果

2.1 4种不同样本的IL-6浓度比较

2.1.1 龈沟液:MODEL组在第1、3、5周3时间点的IL-6浓度变化不大(P>0.05),药物干预后,则M/CMCS组、PERIO组和MNZ组在第1周、第3周和第5周较MODEL组同期均明显下降(P<0.05);3治疗组间比较,M/CMCS组和PERIO组的IL-6浓度值在第1、3、5周时间点均分别比MNZ组同期的浓度值低(P<0.05),在第5周时间点,M/CMCS组IL-6浓度值比PERIO组低(P<0.05)。见表1。

表1 不同药物对大鼠龈沟液中IL-6影响 n=6,pg/mL,

2.1.2 牙周软组织:M/CMCS组、PERIO组和MNZ组各组内的IL-6浓度值,在各组组内第3周和第5周分别较第1周明显降低(P<0.05);与MODEL组IL-6浓度比较,M/CMCS组、PERIO组和MNZ组在3个时间点均降低(P<0.05);M/CMCS组与PERIO组在第3周和第5周均较同期MNZ组为低(P<0.05);M/CMCS组在第5周时低于PERIO组(P<0.05)。见表2。

表2 不同药物对大鼠牙周软组织组织中IL-6的影响 n=6,pg/ml,

2.1.3 牙槽骨:与MODEL组比较,M/CMCS组、PERIO组和MNZ组在第1、3、5周各时间点的IL-6浓度均降低(P<0.05)。M/CMCS组与PERIO组的IL-6浓度值在第1周、第3周和第5周,均分别较MNZ组低(P<0.05)。见表3。

表3 不同药物对大鼠牙槽骨中IL-6的影响 n=6,pg/ml,

2.1.4 全血血清:M/CMCS组、PERIO组和MNZ组在第1、3、5周时间点分别较MODEL组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),但M/CMCS组、PERIO组和MNZ组在相同时间点的组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同药物对大鼠全血中IL-6的影响 n=6,,pg/ml

2.2 4组内不同组织样本的IL-6浓度比较 M/CMCS组、PERIO组和MNZ组,龄沟液、牙周软组织和牙槽骨的IL-6浓度在第3、5周时,均低于第1周(P<0.05);PERIO组牙周组织在第3周和第5周时均高于牙槽骨(P<0.05),MNZ组第3周时牙周组织的值高于牙槽骨(P<0.05)。见表5。

表5 4组不同样本组织的IL-6浓度结果比较 n=6,pg/ml,

2.3 牙周组织IL-6的免疫组织化学结果 在实验结束时间点,MODEL组牙周组织毁损严重,龈乳头溃烂且牙周袋异常明显,附着严重丧失,牙槽骨水平型吸收至根尖;M/CMCS组可见牙龈乳头形态较完整且染色明显局限在上皮组织,牙周袋浅且远中健康牙一侧牙周袋较结扎侧明显浅,且结合上皮未见明显向根部方向退宿,龈牙结合点较对侧少许降低但不明显,龈乳头下的牙龈纤维致密有序,未见明显牙槽骨吸收;PERIO组牙周软组织轻度损伤,但牙槽骨水平型吸收较M/CMCS组严重;MNZ组龈乳头形态受损,龈乳头消失,龈乳头下的牙龈纤维少许紊乱水肿,结合上皮附着向根部部分退缩,牙槽骨水平伴垂直线吸收、面积大且深,染色较深。见图1。

图1 第5周试验结束时大鼠牙周组织IL-6的免疫组织化学染色(n=6);浅黄色、棕黄色表示阳性细胞的染色强度;B:牙槽骨;P:牙周膜;R:牙根

2.4 不同药物对大鼠牙周组织的IL-6免疫组化MOD值的影响 MODEL组IL-6一直处于较高的水平且未随时间产生明显变化;与MOPEL组各相同时间点比较,M/CMCS组、PERIO组和MNZ组分别在第1、3、5周下降明显(P<0.05),但MNZ组的值又明显高于其他2组(P<0.05);在第5周时,M/CMCS组的值也低于PERIO组(P<0.05)。见表6。

表6 不同时间点牙周组织IL-6表达水平(MOD值) n=6,

3 讨论

现在普遍认为IL-6是破骨细胞骨吸收的促进剂,在慢性和急性炎症包括牙周炎的过程中参与骨丢失的发病机制[10,11]。此外,IL-6中和抗体抑制TNF-α和IL-1β刺激的破骨细胞形成[12]。在牙周炎发生发展过程中,IL-6与牙槽骨的代谢关系密切,也是破骨细胞分化和骨吸收的有效刺激因子。IL-6可刺激基质细胞产生破骨细胞生成因子RANKL,RANKL表达水平上调即会导致牙槽骨丢失[13]。牙周炎等一些炎症性疾病过程中,IL-6水平升高[14],且与牙周炎的持续性牙周组织破坏相关,IL-6表达强度与附着丧失呈正相关。

本实验的MODEL组,大鼠上颌骨牙周组织受损严重,牙槽骨呈现水平型吸收几乎直达根尖部位,而IL-6在龈沟液、牙周软组织和牙槽骨的浓度,并没有随着时间的推移而下降。表现为稳定的表达值。但是,结果药物干预后,IL-6的浓度值在牙周局部组织立即出现了明显下降。免疫组化结果显示,药物治疗后牙周组织的IL-6表达明显受到抑制;形态学方面,牙龈和牙周膜纤维的损伤,特别是牙槽骨吸收,药物干预均有不同程度的改善,显示3种药物局部治疗均有效,其中MNZ组表现稍差,而M/CMCS组则优势明显。

本动物模型试验发现龈沟液的IL-6表达水平较全血为高,但是比牙周组织为低,也存在第3周以后变化不明显的情况,在未经药物干预的MODEL组,龈沟液的IL-6表达水平一直稳定且较高。药物干预后,同样的,MNZ组的IL-6表达水平与其他2组药物间存在统计学差异,而M/CMCS组的结果最优。

甲壳素作为牙周治疗的局部药物载体的研究越来越多,壳聚糖基生物支架能够其可以加速新骨再生,促进组织新生血管的形成[15]。采用不同类型的壳聚糖(碱溶性和水溶性)制备壳聚糖阿托伐他汀凝胶,体外研究制剂的抗炎作用,利用TNF-α诱导的人牙龈成纤维细胞(hGF)模型作为实验对象,培养hGF细胞时加入壳聚糖阿托伐他汀凝胶后,测定促炎(IL-1β、IL-6、IL-8)和抗炎(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-10)细胞因子的释放,结果发现多种细胞因子包括IL-6的水平降低,壳聚糖的抗炎作用增强[4]。在大鼠牙周炎模型,同样的壳聚糖制剂采用相同的细胞因子指标进行检测分析,其结果与细胞模型较为一致[5]。国内也开展过相似的体外细胞模型研究,发现不同浓度的羧甲基壳聚糖能够下调同一浓度脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)表达的IL-6,随着羧甲基壳聚糖浓度增加,IL-6表达量呈逐渐减弱趋势[6]。

总之, 通过本次三种不同药物影响牙周炎模型大鼠的IL-6实验结果,在龈沟液、牙周软组织和牙槽骨,药物干预后均出现了IL-6表达水平均减少的现象,且牙周组织病理形态较模型对照组均有不同程度的改善,其中,M/CMCS凝胶表现出一定的优势,说明甲硝唑羧甲基壳聚糖凝胶有一定的抑制牙周炎症时相关组织分泌IL-6的作用,进而发挥出保护牙周组织、减缓牙槽骨吸收的作用。