柚皮苷对骨细胞的作用以及负载柚皮苷的羟基磷灰石复合支架治疗骨缺损的研究

梁 健 苏 睿 宋泉生 伍 亮

骨缺损(bone defect)是指因感染、创伤、肿瘤等因素引起的骨质短缺、骨的结构完整性破坏,增加了骨折不愈合、延迟愈合及骨不连的风险,提高了患肢功能障碍及残疾概率的疾病[1]。骨骼对于较小的缺损具有自我修复的能力,但较大面积缺损会严重影响骨骼的完整性,导致骨骼无法自我修复[2]。骨移植技术被认为是修复骨缺损的有效方式,常见的骨移植材料有自体骨、同种异体骨和人工骨,其中自体骨因具有良好的组织相容性,移植后不会产生免疫排斥反应,是治疗骨缺损的金标准,但因其供应的骨量有限,且容易引起供体部位的感染、不愈合等并发症,难以应用于大面积骨缺损的修复,限制了其在临床上的应用[3,4]。异体骨移植会产生免疫排斥反应,增加传染病的风险,且价格相对昂贵,难以普及临床[5]。随着组织工程的飞速发展,研究发现,负载中药活性单体的复合支架对于骨缺损的治疗具有明显的促进作用[6,7]。

柚皮苷(naringin, NAR)是一种黄酮类化合物,是中药骨碎补的主要有效活性单体成分,可以通过提高碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性、Runt相关的转录因子2(RUNX2)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等成骨相关基因的表达促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化,促进成骨细胞的钙化,并可改变核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)相互作用和诱导破骨细胞凋亡来抑制破骨细胞生成[8,9]。此外,还具有良好的促进血管生成的作用。将柚皮苷与生物支架制成复合物,可以有效修复骨缺损。本文通过总结应用负载柚皮苷的支架材料修复骨缺损的相关研究进行综述,以期为后续的临床和科研工作者提供相应依据。

一、柚皮苷对骨细胞的影响

1.柚皮苷对成骨细胞的影响:骨组织的稳定依赖于成骨细胞与破骨细胞分化和凋亡的动态平衡,当这种平衡被打破,将会导致骨代谢疾病的发生[10]。成骨细胞是调节骨形成的细胞,对骨骼的生长和维持至关重要,通过分泌相关活性物质骨钙素、硬化素等,促进骨形成,维持骨量的相对稳定[11]。

刘小坡等[12]应用柚皮苷灌服老年大鼠骨质疏松性骨折模型发现,4周后能明显观察到大鼠股骨组织骨小梁数量明显增加,并且出现较多的成熟小梁状骨,同时BMP-7的表达量明显上调,表明柚皮苷可以促进新骨形成。侯婷婷等[8]通过使用含有柚皮苷的复合支架对人牙髓干细胞进行体外培养发现,应用含有柚皮苷的复合支架可以增加ALP的活性,提高RUNX2、BMP-2蛋白的表达量,促进矿化结节的形成,表明柚皮苷可以促进人牙髓干细胞的增殖以及成骨分化。覃浩然等[13]通过使用不同浓度的柚皮苷对兔骨髓基质细胞进行体外干预发现,48h后细胞内有明显的钙沉积物形成,并且可增加细胞内骨保护素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平,促进兔骨髓基质细胞成骨分化。

2.柚皮苷对破骨细胞的影响:破骨细胞是骨组织中唯一的骨吸收细胞。RANKL/RANK/OPG信号通路是调节破骨细胞分化、成熟的重要信号通路[14]。破骨细胞分泌的受体RANK是成骨细胞所分泌的RANKL的信号受体,两者相互结合可促进破骨细胞的活化和成熟,并且抑制其凋亡[15]。OPG是一种调节骨吸收的可溶性蛋白,又称破骨细胞生成抑制因子,具有诱导破骨细胞凋亡、抑制骨吸收的作用[16]。OPG可竞争性结合RANK,阻断RANKL与RANK结合,阻止破骨细胞的分化和成熟,发挥骨保护因子的作用[15]。

秦红霞等[16]对成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)进行培养,3天后检测OPG和RANKL的表达水平,发现在脂多糖刺激下OPG表达水平均较低,RANKL表达水平较高,而加入柚皮苷后能明显增加成骨细胞增殖能力、ALP活性,同时提高OPG/RANKL的比值,表明柚皮苷通过上调成骨细胞OPG/RANKL的比值,抑制破骨细胞的分化和骨吸收。此外,赵志虎等[15]研究显示,在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中,柚皮苷可以促进成骨细胞OPG、RANKL的表达,提高OPG/RANKL的比值,抑制破骨细胞的分化。

二、负载柚皮苷的羟基磷灰石复合材料

羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)和纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite, n-HAP)具有良好的生物相容性、生物活性、生物降解性、无毒性和骨传导性,在体内能够与骨骼形成强有力的结合,并让药物缓慢结合并释放到骨骼上,在降解同时释放的无机离子可诱导骨生长,促进骨缺损的修复,作为促进骨再生的药物输送载体而受到骨组织工程的广泛关注[17,18]。

1.柚皮苷复合纳米羟基磷灰石-胶原蛋白:nHAp是人体骨、牙无机组成的主要成分,植入体内后可被人体组织吸收和取代,有效促进骨骼的生长,是一种理想的骨修复材料,被广泛应用于骨科、口腔组织工程等领域[19,20]。胶原具有良好的生物相容性,有助于促进细胞的增殖和成骨分化[21]。纳米羟基磷灰石/胶原(collagen, COL)复合材料结合了纳米羟基磷灰石、胶原的优势,具有良好的生物相容性、可降解性以及骨传导性,通过提高血管内皮生长因子水平促进局部微血管的形成,加速骨缺损部位修复,是一种相对理想的、新型可降解的骨替代材料[22]。侯婷婷等[8]研究发现,柚皮苷-羟基磷灰石/胶原复合支架(NAR-HAP/COL)具有良好的结构和生物性能,在体内不易降解,能够为种子细胞的生长、增殖、分化和黏附提供优良条件,在体外可促进人牙髓干细胞的增殖以及成骨分化。左艳萍等[23]采用原位合成法制备柚皮苷-纳米羟基磷灰石胶原复合材料(NAR-nHAP/COL),发现该材料抗压强度为119.74MPa,与人体骨骼接近,且柚皮苷的化学结构基本稳定,性能良好,有利于柚皮苷生物活性的发挥。然而,李晋玉等[24]将骨碎补总黄酮置于纳米羟基磷灰石-胶原复合材料与成骨细胞-血管内皮细胞共培养体系中发现,成骨细胞和血管内皮细胞均表现出良好贴附、生长和增殖能力,但骨碎补总黄酮并不能促进该共培养体系中血管内皮细胞的增殖,认为血管内皮细胞的增殖可能与成骨细胞分泌成纤维细胞生长因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)有关。

2.柚皮苷复合羟基磷灰石-壳聚糖:壳聚糖是一种具备良好的生物相容性、吸附性、生物降解性以及骨传导性的聚合物,在促进神经修复、伤口愈合、药物运输方面具有较大优势,是治疗骨缺损的理想材料[25]。梁卫寰等[26]采用共沉淀的方法制备载柚皮苷的羟基磷灰石/壳聚糖人工骨载药体系,发现该复合物具有良好的抗压强度以及药物缓释作用,在降解的过程中可以缓慢释放柚皮苷,可持续地发挥促进成骨的作用,并且其药物释放速率以及降解速率随壳聚糖含量的增大而增大。卢育南等[27]将柚皮苷-壳聚糖/羟基磷灰石复合支架植入大鼠颅骨骨缺损模型中,4周后发现该支架可提高缺损部位骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的表达,同时CT扫描显示新生骨广泛填充了缺损孔隙,骨缺损修复良好,与对照组比较,壳聚糖/羟基磷灰石为柚皮苷提供了良好的载体,加速新生骨组织的形成。

3.柚皮苷复合羟基磷灰石-丝素蛋白:丝素蛋白(silk fibroin, SF)作为一种天然聚合物,具有优异的机械强度、良好的生物相容性、可塑性以及生物可降解性,可与其他生物材料结合形成复合支架,模拟自然骨环境,诱导成骨,是目前组织工程中的研究热点材料之一[28]。Zhao等[29]研究发现,运用镶嵌柚皮苷的复合丝素蛋白/羟基磷灰石 (NG/SF/HAP) 支架培养人脐带间充质干细胞,与不含柚皮苷的SF/HAP支架比较,柚皮苷可以促进人脐带间充质干细胞长入SF/HAP支架并促进成骨分化,并且在 NG/SF/HAP支架中培养的细胞的成骨和血管生成能力优于在 SF/HAP支架中培养的细胞,表明掺入柚皮苷的SF/HAP复合支架具有具有骨诱导性、血管生成活性以及骨再生的潜力。Yu等[30]先把柚皮苷加载到明胶微球(GM)中,在将这些微球被封装在丝素蛋白 (SF)/纳米羟基磷灰石 (nHAP) 支架中制成柚皮苷/明胶微球/纳米羟基磷灰石/丝素蛋白 (NG/GMs/nHAP/SF)三维支架,并指出该支架具有良好的生物相容性、生物力学强度,并促进BMSCs黏附、增殖和体外钙结节的形成,植入实验动物体内后可促进骨缺损的修复。

三、展 望

柚皮苷是中药骨碎补的主要有效单体成分,是一类天然存在的二氢黄酮类化合物。现代药理学研究发现,柚皮苷可通过促进成骨细胞的增殖和抑制破骨细胞的分化,进而促进骨形成,调节骨代谢,可用于治疗骨质疏松症、骨缺损等骨科疾病。羟基磷灰石是一种天然的生物材料,是人体骨骼中的主要无机成分之一,具有良好的生物相容性、降解性和骨传导性,可与胶原蛋白、壳聚糖、丝素蛋白等生物材料结合形成复合支架,并作为药物载体负载柚皮苷,增强成骨分化、促进骨形成的能力,是组织工程的研究热门材料,可用于骨缺损的修复。目前,负载柚皮苷的羟基磷灰石复合支架材料修复骨缺损仍处于细胞实验和动物实验阶段,均取得明显的修复骨缺损的治疗效果,在理论和实践上表明了负载柚皮苷的羟基磷灰石复合支架材料的安全性和有效性,然而,尚未有关于临床应用的报道。随着骨组织工程和再生医学的飞速发展,期望今后深入开展负载柚皮苷的羟基磷灰石复合支架研究,为骨缺损的治疗提供更多途径。