液相芯片技术在动物遗传育种中的应用

2023-09-06张格阳吕世杰朱肖亭翟亚莹张志浩施巧婷张子敬屈俊峰陈付英王二耀

中国畜禽种业 2023年6期

张格阳，吕世杰，朱肖亭，翟亚莹，张志浩，施巧婷，张子敬，屈俊峰，陈付英，王二耀*

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州 450002；2.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450002；3.河南省科技创新促进中心，河南郑州 450008）

随着全球化的深入发展，畜禽产品需求逐年递增，中国畜牧业得到了高速平稳的发展。畜禽种业是畜牧业的源头，是畜牧业发展的重要环节。我国畜禽种业在经历了高速平稳的发展后，面临着一些卡脖子的问题，虽然我国种业技术发展已有长足进步，但在种质资源创新和基因编辑等核心技术方面，仍相对滞后。这导致了种业发展的瓶颈，也限制了中国在全球种业产业链中的作用。液相芯片技术的开发与应用，在协助育种工作者培育高品质优良畜禽品种中发挥了极大的作用。

1 概念和原理

液相芯片体系是一种通过聚苯乙烯微球制备的液相芯片系统，其主要基材是粒径均匀直径为5.5～5.6μm 的圆形微球[1]。该微球可以悬浮于液相中，构成了一个液相芯片系统。微球上的不同探针分子可以与待测物特异性结合，利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测。液相系统中的微球通常都具有独特的荧光编码或称为色彩编号，可以通过荧光染料或者其他的方法进行标记。其中，荧光编码是一种常见的方法[2,3]，通过在制造微球时将不同荧光染料混合在一起，使得微球具有不同的荧光信号和颜色。这样一来，每种颜色的微球可以固定不同的探针分子，完成对多种不同物质的同时鉴定和检测。

在液相芯片技术中，测试样品和报告分子被添加到96 孔板的培养基中与标记的微球反应。靶分子[3]（如待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段和酶等）会与探针和微球上的报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带报告分子生物素和荧光素。通过这种标记，在液相芯片技术中既能快速地对生物分子进行分析，还能进行多帧实时动态图像的记录。

2 液相芯片的特点

2.1 液相芯片技术优势

液相芯片技术相对于传统的免疫学和核酸检测方法具有以下几个优点。

2.1.1 高通量

不同于传统免疫分析方法，液相芯片技术可以同时实现多种分子的检测及分析，可以在同一样本中快速、准确地进行不同目分子的定量和定性检测，且用于检测的微球种类数可多达100种。利用液相芯片技术，可以通过将荧光标记在磁性微球表面，利用微流控系统将样本与微球混合，并通过激光束对荧光强度进行检测，实现对多种不同目的分子同时进行实时定量、定性分析，具有较好的重复性。

2.1.2 样本用量少

液相芯片技术可以通过对芯片表面进行不同标记物的打印和生物分子的修饰，实现在同一个反应孔中同时完成多重生物学反应的检测。这种技术在很大程度上降低了需要的样本和试剂用量，降低了生物实验成本，缩短了试验时间，提高了生物分析效率。

2.1.3 操作简单、快速

液相芯片技术建立在液相反应动力学基础上，因此可以通过微流控调控反应条件来控制反应速度，以实现目标分子的快速检测。相比传统的固相检测方法，该技术的检测步骤更简单、更快速。免疫学分析时，选择高亲和力抗体，只需2～3h 即可完成检测，同样的，核酸杂交分析也只需要在PCR 扩增后不到1h 就能得到精准结果[4]。液相芯片技术除了反应速度更快之外，还具有样品孵育时间更短的优点。因为液相芯片技术所采用的液相反应动力学模型自身具备快捷的反应过程，从而使其在样品检测方面具有更高的时效性和敏感性。液相芯片技术通过微型化和自动化的实验平台，可以大幅度减少实验工作量和人力成本，数据分析过程也相对简单快捷。

2.1.4 数据质量高

液相芯片技术可以同时检测多种待测分子，可以减少样本的消耗，并且可以避免数据偏差和误差，保证数据质量。

2.1.5 特异性强

液相芯片技术可以通过荧光检测技术实现高效、无需洗涤的自动化检测。同时，液相芯片微球与待测分子之间的结合通常是高度特异性的，这意味着只有目标分子与微球结合后才会形成复合物，并通过共振能量转移产生荧光信号，未结合的分子不会产生干扰。

通过对两类传感器接收信号的分析与比较，发现R6α传感器与Nano30传感器均能得到较为准确的实验数据。但是相比较而言，R6α频带窄，但响应快，能尽可能多地接收到信号，保证岩石破裂过程的声发射表征更为准确。此外，还可以隔绝一些其他频段的噪声信号干扰，保证时序能量表征的准确性，因此适合分析声发射时域规律。而Nano30频带较宽，对于一些频率成分较丰富的突发性信号，在频率上能够尽可能保证声发射信号的完整性，保证岩石破裂过程声发射信号频率分析更为全面，故更适合分析岩石声发射信号波形特征。此外，由于频段较宽，一些非破裂信号也会采集到，在分析时应进行去噪处理。

2.1.6 准确性高

根据荧光信号强度与待测分子的浓度成正比，可以通过对荧光信号的测量来间接检测待测物质的存在及浓度大小，不需要像ELISA 检测中那样将样本多倍稀释，这可以减少误差来源，提高检测的准确性。

2.1.7 灵活性强

液相芯片技术还可以对多种不同类型的样品进行检测，如生物组织、体液等，同时，液相芯片技术在检测样品时通常无需做进一步处理，比如无需进行浓缩或稀释。不仅可以用于核酸检测，还可以应用于蛋白质研究。使用商品化试剂盒进行分析时，可以根据具体的检测项目，选择合适的交联微球和标记分子的探针，并对其进行灵活调整。

2.1.8 检测范围广

液相芯片检测范围广，主要包括细胞因子检测、免疫分析、感染性疾病检测、自身抗体检测、疫苗效果评价、单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）检测、免疫球蛋白分型等。液相芯片技术在分析速度、灵敏度、通量等方面有着极大的优势，广泛应用于分子诊断、药物筛选、生物学研究以及临床实践等领域。

2.2 液相芯片技术劣势

2.2.1 实验操作要求高

对于一些复杂的样本（如血液、唾液等），还需要进行一些样本前处理，操作难度相对较大。液相芯片技术需要进行多步骤操作，操作方法综合要求比较高，不易上手，需要培训和专业知识。

2.2.2 初始设备和引物的制备成本高，原材料采购价格高昂

对于新的检测目标，首先需要开发适当的测量信号，同时应选用不同种类的微小颗粒，这需要前期高昂的投资。荧光编码微球是目前制备液相芯片技术的核心设备，国内技术发展的滞后给液相芯片相关产业的发展带来了诸多困难与挑战。国外垄断了制备液相芯片的高性能、高附加值的荧光微球材料，国内所使用的材料几乎都从国外高价进口，因此国内液相芯片的发展也受到了极大的阻碍。

3 液相芯片在动物遗传育种领域的应用

3.1 液相芯片在全基因组关联分析和全基因组选择育种中的应用

随着高通量基因测序技术的发展，科学家们根据研究需求设计了不同类型的液相芯片用于畜禽遗传特性解析、品种鉴定、资源保护和新品种开发等工作，例如 “神农1 号” 地方鸡基因组系列液相芯片、“吉牛1 号” 肉牛20K 液相育种芯片、湘猪64K cGPS 液相芯片、绵羊40K 液相基因芯片等。郭应威[5]基于靶向捕获测序技术的40K 绵羊液相芯片，其中包含了40156 个标记位点。该芯片利用高通量技术，对323 只湖羊和东佛里生绵羊杂交F2代（即东湖羊）进行基因分型，筛选后检测到209625 个高质量SNPs，其目标位点平均捕获效率达99.7%，平均测序深度为70X。邱奥等[6]开发的猪50K SNP 液相芯片是一种用于品种鉴定、系谱校正、基因定位和基因选择等多种用途的芯片。它提供了高通量的检测能力，包括50000 个位点，可以高效地检测多个位点，从而加速了品种鉴定和遗传研究。陈宇[7]等研究表明，将猪液相芯片从10K 基因位点扩充到50K 是可行的。这一扩充方案可以在大规模的基因组选择中应用，并降低相关育种成本。实验中，研究团队增加了代谢和育种相关基因组位点的数量，从而实现了猪基因组育种信息资源的扩展。

3.2 液相芯片在疾病抗性选择育种中的应用

现代动物育种的目标之一是提高动物的疾病抗性。传统的家系育种方法受到诸多限制，如多性状选择的难度大、易造成血缘增强（Inbreeding）等。相比之下，利用分子标记技术进行选择，尤其是针对涉及多个基因的特殊疾病，可以更为准确地选择具有高抗性的个体。相应地，针对不同物种疾病的抗性液相芯片的研究将有助于提高动物的抗性选择准确性，加速育种进程。

刘锦宇等[8]开发了液相芯片40K SNP “黄海芯1 号”，利用该芯片对AHPND 抗性测试个体进行基因分型，并通过ssGBLUP 与ssBR 等方法复合系谱和基因型信息，评估AHPND 抗性，极大提高了AHPND 抗性的选择准确性。丁向东等[9]研究利用实例确证了液相芯片在基因组选择育种中的高效性。与传统的基因组选择策略相比，液相芯片技术能够同时检测多个位点，从而大幅缩短了育种周期，并且检测成本也大幅降低。这一技术的优越性表现在成本更低、育种效率更高、易于实现等方面。在丁向东等[9]的实验中，液相芯片技术成功地筛选出具有理想性状的优异品种，为育种工作带来了加速效果。郭喜玲等[10]研发了一种能识别甲型流感病毒的NP 基因、乙型流感病毒的HA 基因以及H5N1 亚型AI 病毒的H5 和N1 基因的液相芯片技术，其对病毒核酸的检测灵敏度可达1pg。Lamaire 等[11]人建立了一种多重液相芯片方法，用于区分单一和混合感染中的禽呼吸道病毒。这个液相芯片方法可以同时检测AIV、NDV、IBV 和ILTV，而且用时更短，样本需求更少。采用液相芯片技术对70 个临床样本进行了准确的检测，并证实该技术的检测结果与单一实时荧光定量PCR 一致。王慧煜等研究人员设计了一种基于微球偶联的探针，针对禽流感病毒M 基因进行液相芯片检测。试验结果显示，该方法具有特异性，可以特异性地检测出禽流感病毒；同时，该方法的最低检出量也非常低，仅为10-4ng/μL 的病毒核酸。刘春梅[12]利用液相芯片技术建立了同时检测小鼠三种病毒的方法。王莹[13]通过液相芯片技术建立多种猪源性外来病液相芯片检测的方法。杨显超[14]利用液相芯片技术建立了同时检测猪繁殖障碍病毒的方法。张晓娜等[15,16]建立的AIV 多重液相芯片技术具有高度的特异性和灵敏度。该技术对禽流感病毒的H5、H7 和H9 亚型识别特异性很高，并且经过优化，可以同时识别多个流感病毒亚型，包括NDV、IBV、ILTV 等至少6 种病毒。该技术敏感性明显提高，最低检测限可达到10-4ng/μL 的病毒核酸，相对于传统的RT-PCR/PCR 检测方法，具有更高的检测能力。Wu 等[17,18]开发了一种液相芯片分析方法来监测兔出血性疾病病毒（RHDV）、兔轮状病毒（RRV）和仙台病毒（SeV）三种兔病原体的核酸。该方法的三种病毒的检出限为102 拷贝/μL。经过检测，使用这种方法得到的结果与常规的RT-PCR 检测结果一致。刘志玲等[19]人基于原核表达技术，构建了一种牛白血病病毒(gp51)的重组蛋白抗原。利用该抗原，他们建立了一种液相芯片检测技术，用于检测牛白血病病毒抗体。实验结果显示，该技术具有极高的敏感性，达到119.7ng/μL。样本量为169 份的临床牛血清中，该技术检测出阳性率为57.4%。此外，与ELISA 试剂盒检测结果对比，液相芯片技术的检测结果符合率高达94.67%。该项研究成果为日后多重液相芯片检测牛病的研究奠定了基石，为动物疫病的相应研究提供了有益的启示。

3.3 液相芯片在检测动物致病基因研究中的应用

筛选动物的致病基因，能够帮助人们更好的了解和研究致病基因与疾病之间的关系，为动物的遗传育种提供参考。

有研究使用液相芯片技术检测了斑马鱼体内基因的表达水平，发现MYH6 和MYH7 等关键基因的表达显著上调，这些基因与人类肝癌、肝炎等疾病的发病机制密切相关。这一结果为基于斑马鱼模型进行肿瘤等多种疾病的研究提供了有力的支撑[20]。根据研究，Aβ 和Tau 基因表达的变化是导致阿尔兹海默症发生的重要原因。研究人员使用液相芯片技术对帕金森病和阿尔兹海默病模型的海马体组织中的miRNA 进行检测，并发现了两种疾病模型中表达显著的两种miRNA：miR-27a-5p 和miR-148a-5p[21]。研究者使用液相芯片技术筛查了脂肪肝大鼠模型的肝脏组织，发现TLR2、TLR4 和CCR2 等基因的表达水平显著上调。这些基因的表达受到脂肪肝的刺激，并且能够调控细胞因子的分泌[22]。