种公猪精液品质候选基因的研究进展

吴 雨，周 迪*，陈 琨，蒋桂荣，杨 蓉，王 燕，敖 叶，方 华，王 舍

（1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 550018；2.贵州省人民医院医学遗传科，贵州贵阳 550002）

中国幅员辽阔，地大物博，自然环境复杂多样，为地方猪种群多样性演化提供了得天独厚的条件[1]。近年来，国家出台了一系列方针政策大力推进农业现代化发展，2022 年中央一号文件指出要全面实施 “种业振兴” 战略，打好种业 “翻身仗”。其中健全生猪产业平稳有序发展长效机制，加强制种基地和良种繁育体系建设是未来养猪产业发展的重中之重。2022 年农业农村部为进一步加强制种基地建设，聚焦生猪遗传改良，在全国范围内组织遴选5 个国家级核心种公猪站，通过核心育种群公猪精液交换，实现群体间遗传物质交流，大力推动种猪联合育种工作，体现了国家对种公猪繁育体系建设的重视程度和实施力度，表明优良种公猪的选育选配在现代化养猪生产中占有重要地位。在养猪业中，生猪养殖经济效益很大程度上受种猪种用价值的影响，包括公猪的繁殖率、母猪受孕率以及产仔数等生产性能指标，这与公猪精液质量的好坏密不可分[2]。

目前评价种公猪精液品质主要集中在精子的密度、活力、形态、膜生化活性和DNA 片段化等常规形态学参数上，在研究候选基因对公猪精液质量影响的相关报道较少。研究证实，遗传是影响种公猪精液质量最为重要的因素之一，不同地方猪种由于遗传特性不同，精液品质存在一定差异[3]。近年来，研究人员先后从人类、小鼠以及家畜精液中检测出影响精液品质的候选基因，包括AKAP3、HSF-1、WIP1和SPATA6等基因，通过信号传导、基因重组和编辑等方式，能够有效调节精子相关因子的表达，从而影响精子的获能和运动，这对进一步揭示种公猪繁殖性能的遗传机理和加强高繁殖力种猪的选育具有重要的理论指导意义。因此，本文主要从分子遗传学角度介绍精液品质相关基因在猪方面的研究进展，旨在更高效、精准对种公猪精液品质进行评价，为后续公猪精液质量研究奠定基础。

1 AKAP3 基因

1.1 AKAP3 基因结构

A 型激酶锚定蛋白3（A-kinase anchoring protein3，AKAP3）属于A 型激酶锚定蛋白（A-kinase anchoring proteins，AKAPs）家族，是一类精子特异性蛋白，具有结合PKA 保守区和引导AKAP-PKA 复合体到亚细胞位点的靶向区[4]，调节精子纤维鞘的组成，参与精子的获能和运动[5]。不同物种之间AKAP3基因结构略有差异，其中猪AKAP3基因定位于5 号染色体，包含7 个外显子和6 个内含子，全长27288bp，编码855 个氨基酸。

1.2 猪AKAP3 基因研究现状

研究表明，AKAP3基因主要在精子形成过程中的减数分裂后表达，能够有效调节哺乳动物精子相关因子表达、染色质浓缩、获能和运动，在精子前体细胞形态变化和调节精子功能中起重要作用[6]。目前，AKAP3基因在猪方面的研究多集中在精子形态变化、磷酸化水平以及蛋白发生原理上。研究证实，哺乳动物精子在获能过程中发生多种变化，包括cAMP 水平的增加、膜流动性和细胞内蛋白酪氨酸磷酸化增加，其中酪氨酸磷酸化与AKAP3蛋白存在互作[7]。Mahabadi 等[8]采用实时荧光定量PCR 和流式细胞术检测发现AKAP3基因在雄性生殖细胞系的不同阶段均有表达，推测该基因可能为机体生殖细胞发育的关键调控因子。随后，免疫沉淀和western blot 检测分析显示，精子获能需要AKAP3的降解，其降解程度受酪氨酸磷酸化水平调控，可通过抑制酪氨酸激酶增强AKAP3的降解，促进精子获能[9]。Qu 等[10]利用共沉淀法检测AKAP3蛋白对猪精子功能的影响，在精子获能过程中，通过抑制蛋白酶体，PKA 与AKAP3之间发生解耦并被UPP 降解，解耦的PKA-AKAP3 进一步诱导酪氨酸磷酸化水平降低和丝氨酸苏氨酸磷酸化水平升高，从而对猪精子获能产生影响。改变机体精子中cAMP 含量，会引起精子活力改变[11]。故在对约克夏公猪和杜洛克公猪的研究中发现，AKAP3可通过cAMP/PKA 信号通路参与两个猪种的精子发生，有效调节精子运动、纤毛形态发生、精卵识别和获能等生理功能[12]，其中杜洛克公猪AKAP3蛋白含量显著高于约克夏公猪，表明该蛋白对杜洛克公猪的精子作用效果更明显，推测可能是由于不同品种间遗传资源背景不同所导致。同时，有研究发现AKAP3缺失导致成熟精子中RNA 代谢和翻译因子的积累以及PKA 亚基的位移，使精子蛋白组发生全局性的错误定位[13]，进一步证实AKAP3在猪精子蛋白质组、精子形态和获能中的巨大作用，提示其可作为公猪精液品质的候选基因。此外，AKAP3基因在牛、小鼠、人类精子发育中也有相关研究，且均对精液质量具有重要影响。小鼠AKAP3基因敲除后，精子蛋白17（Sperm protein 17，Sp17）mRNA 表达下降，导致小鼠精子形态存在缺陷，发生不育障碍[14]。Karanwal 等[15]通过免疫细胞化学分析证实AKAP3是牛精子中与生育相关的差异丰富蛋白，提示其可作为预测水牛生育力的潜在候选蛋白。Liu 等[16]对150 例中国汉族男性弱畸形精子症患者进行遗传学分析，结果显示，患者精子中AKAP3基因均发生错义突变且表达显著降低，表明AKAP3可作为一个新的基因参与人类弱畸形精子症研究。综上，可知AKAP3基因在哺乳动物精液品质方面的研究已有相关报道，并取得一些成果。其中AKAP3基因对猪精子功能的影响机制被证实，具有潜在的调控作用。因此，AKAP3基因可作为公猪精液品质候选基因进行分子遗传辅助标记。

2 HSF-1 基因

2.1 HSF-1 基因结构

热休克转录因子1（Heat shock factor 1，HSF-1）属于热休克（heat shock transcription factors，HSFs）转录因子家族，是一种具有热激活DNA 结合能力的转录调节因子，可介导真核生物热休克蛋白基因的应激诱导表达。该基因存在4种不同的HSF-1蛋白亚型（HSF1α、HSF1β、HSF1γα、HSF1γβ），且在哺乳动物睾丸组织中高表达[17]。其中猪HSF-1基因定位于4 号染色体，包含15 个外显子和14 个内含子，全长22953bp，编码653 个氨基酸。

2.2 猪HSF-1 基因研究现状

哺乳动物的热应激是由一系列热休克转录因子家族（HSFs）水平调控的，即HSF-1、HSF-2、HSF-3、HSF-4。其中HSF-1 是该家族的主要调节因子，可通过诱导相关因子转录，上调热休克蛋白（HSPs）的表达来启动热休克反应，以抵消环境温度升高引起的细胞损伤[18]。非应激条件下，HSF-1以单体形式出现，当机体受到热或其他形式的应激时，HSF-1则转化为一种 “活性” 的三聚体形式，通过DNA 结合，诱导编码分子伴侣基因（HSP40、HSP70和HSP90）转录，从而促进精子细胞的增殖分化[19]。目前，HSF-1基因在猪方面的研究主要集中在各组织器官以及精液的mRNA 表达上。研究发现，HSF-1基因敲除小鼠，其生殖细胞在减数分裂前期发生粗线期增殖停滞，导致初级精母细胞大量凋亡，造成睾丸发育不全，说明HSF-1除了受热应激刺激发挥功能，在生理条件下对机体精子发育也起着至关重要的作用[20]。随后，HSF-1基因在杜洛克猪、霍寿黑猪和长白猪的研究结果中显示，该基因在上述3 个猪种的精液中均有表达，其中杜洛克猪mRNA 表达量最高，与其他两个猪种达到差异极显著；相关性分析显示，HSF-1基因与霍寿黑猪的精子密度和顶体完整性呈极显著正相关。HSF-1基因表达越高，霍寿黑猪的精子密度越高，具有正向调控精子顶体完整性的作用，表明其对霍寿黑猪精液品质影响较大，后续可进一步开展基因功能和机制验证；而HSF-1基因在杜洛克猪、长白猪精液的各项性能指标中均无显著相关性[21]，推测可能是由于品种之间存在个体差异，遗传效能不同所导致。除了在猪精液中表达，研究人员在90～210 日龄的公猪中发现随着年龄增加，HSF-1基因在其肌肉、脂肪、胃等组织器官的mRNA 表达也随之增加，推测其对猪的多个组织器官生理发育起着重要作用[22-23]。此外，HSF-1基因在人体衰老、癌症以及一些神经退行性疾病中也有相关研究，具有作为治疗生物靶点的潜力[24]。通过以上报道可知，HSF-1基因对部分猪种的精子密度、顶体完整性等指标存在相关性，但具体调控机制尚未阐明。目前HSF-1基因在公猪精液中的相关研究报道不多，还有待深入探究。

3 WIP1 基因

3.1 WIP1 基因结构

野生型p53 诱导的磷酸酯酶1（Wild-type p53-induced phosphatase 1，Wip1）属于蛋白磷酸酯酶2C（Protein phosphatase type 2C，PP2C）家族，是一种丝氨酸/ 苏氨酸磷酸酶，Fiscella 等[25]于1997 年首次通过γ 射线和UV 射线诱导发现，可广泛调节哺乳动物体内多种类型细胞的增殖分化、凋亡以及DNA 损伤修复等生理活动。目前WIP1 基因定位于4 号染色体，包括2 个外显子和1 个内含子，全长2249bp，编码690 个氨基酸。

3.2 猪WIP1 基因研究现状

在哺乳动物生殖细胞发育过程中，WIP1基因通过活化位点去磷酸化，与Nemo 样激酶（NLK）发生相互作用，进一步磷酸化反向调控因子LEF1，降低其活性，最终导致Wnt 信号增强，从而促进精子的发生和获能[26]。研究发现，通过抑制WIP1基因的活性可增强精子父本DNA损伤修复的氧化应激，严重阻碍精子DNA 修复，导致机体精子活力受到影响[27]。随后，Wei 等[28]发现WIP1基因在小鼠睾丸组织中高表达，且WIP1基因敲除小鼠表现出明显的雄性生殖缺陷，包括睾丸变小、精子发生障碍和生育不良，证实WIP1基因对雄性动物生殖器官的发育具有潜在调控作用。目前，WIP1基因在猪方面的研究主要集中在精液mRNA 表达、基因敲除以及发生原理上。在杜洛克猪、霍寿黑猪和长白猪的研究中发现，WIP1基因在3 个猪种的精液中均有表达。其中，在长白猪中mRNA 表达量最高，与其他2个猪种呈极显著差异；相关性分析显示，WIP1基因表达量与杜洛克猪的精子活力和精子DNA完整率呈显著负相关；与霍寿黑猪的线粒体完整性、精子活力和鞭打速率呈显著负相关。表明WIP1基因对2 个猪种的精液品质相关参数具有反向调控作用，推测通过下调该基因表达量，可一定程度上改善其精液质量，增强公猪繁殖力；而与长白猪的精子活力和DNA 完整性呈显著正相关[21]，说明WIP1基因正向调控长白猪的相关精液指标，通过上调该基因表达量，促进其精子发生。总体上看WIP1基因对上述3 个猪种的精液品质均有较大影响，与猪精液品质各项性能指标密切相关。随后，Wang 等[29]采用猪睾丸支持细胞系（Sertoli），研究WIP1基因是否调节Sertoli细胞的增殖、参与雄性生殖。结果显示，抑制WIP1 表达抑制猪Sertoli 细胞增殖，增强P53 表达，提升P53 磷酸化水平，表明WIP1通过抑制P53 磷酸化而正向调节猪Sertoli 细胞的增殖。Xu等[30]研究发现WIP1基因敲除猪表现出明显的雄性生殖障碍，精液的数量和精子质量显著下降，进一步证实WIP1基因在公猪精子发生过程中的重要作用。此外，Sun 等[31]研究发现通过下调WIP1可显著抑制男性前列腺癌（Prostate cancer，PCa）细胞的增殖、侵袭和克隆能力，提示其可能是治疗PCa 的潜在治疗靶点。综上，已证实WIP1基因在公猪、小鼠以及人类的精子发生中具有潜在调控作用，且对不同品种猪的精子活力、DNA 完整率以及线粒体完整性等指标存在显著相关性。因此，提示WIP1基因可作为公猪精液品质候选基因进行分子遗传辅助标记。

4 SPATA6 基因

4.1 SPATA6 基因

精子发生相关基因6（Spermatogenesis associated 6，SPATA6）属于精子发生相关（Spermatogenesis associateds，SPATAs）基因家族，可直接参与动物体精子细胞的发育和生殖。不同物种之间SPATA6基因结构略有差异，该基因最早在老鼠睾丸中发现，定位于5 号染色体，编码488 个氨基酸[32]。而猪SPATA6基因则定位于6号染色体，由13 个外显子和12 个内含子组成，全长131221bp，编码489 个氨基酸。

4.2 猪SPATA6 基因研究现状

SPATA6基因是一类保守的睾丸特异性基因，可调控精子发育后期顶体的形成，对精子的发生、成熟和受精起着重要作用[33]。原位杂交实验分析显示，SPATA6基因在哺乳动物睾丸的所有细胞类型中均有表达，其中精子细胞表达量最高，且SPATA6表达丰度与精子数量、活力和形态呈正相关[34]。研究发现，SPATA6基因失活导致启动子区域DNA 高度甲基化，影响精子产生途径，造成睾丸发育不全，出现生殖障碍[35]。目前，在猪方面的研究主要集中在基因多态性检测和组织表达上。Song 等[36]发现SPATA6基因在大白猪不同器官组织中均有表达，其中睾丸组织mRNA 表达量最高，具有组织表达特异性。对该基因的核苷酸多态性检测结果显示，长白猪中有两个突变位点，分别是rs341061477 位点和rs331255092 位点。随后，周佳伟等[37]选取177 头杜洛克猪和78 头大白猪进行基因分型验证，从SPATA6基因中扩增含有上述两个SNPs 位点的DNA 序列进行分型检测。结果显示，这两个个SNPs 位点与两个猪种的精子畸形率、精液量等指标均存在显著相关性，其中两个SNPs 位点在大白猪中均存在优势等位基因T，杜洛克猪的rs331255092 位点优势等位基因为A，进一步证实SPATA6基因对不同品种猪的精液品质存在潜在调控作用。与此同时，研究人员相继在其他猪种的中发现rs330516022、rs342323574、rs321193752 和rs338297955 等突变位点[38]，且与公猪精液品质性状均呈正相关，表明在不同种猪中SPATA6基因多态性丰富，遗传多样性程度高，选择潜力大，其可作为猪精液品质性状的分子辅助标记。此外，SPATA6基因在其他动物身上也有研究。Li等[39]发现过表达SPATA6基因会显著促进绵羊睾丸间质细胞的增殖分化以及睾酮激素的分泌。通过基因多态性筛选，检测出绵羊的第72272 处发生T>C 突变，提示其可作为选育高繁殖力的绵羊的分子标记。彩丽干[40]通过实时荧光定量PCR 技术检测出蒙古马性成熟后睾丸SPATA6基因的表达量是性成熟前的2 倍。通过上述实验结果可知，在不同家畜中检测出的SPATA6基因多态性丰富。其中在公猪精液中存在多个突变位点，较其他家畜选择潜力大，且在睾丸组织中特异性表达。故提示该基因可作为公猪精液品质候选基因进行研究。

5 MTHFR 基因

5.1 MTHFR 基因结构

亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是一种细胞质酶，通过催化亚甲基四氢氰酸酯将其还原为甲基四氢叶酸，为体内生殖细胞辅助因子合成提供甲基供体，从而保障精子发生。此外还参与机体叶酸以及同型半胱氨酸代谢，广泛调控内部各项生理变化，对机体的生长发育具有重要作用[41]。猪MTHFR基因定位于6 号染色体，包含13 个外显子和12 个内含子，基因序列长约18482bp，编码2396 个氨基酸。

5.2 猪MTHFR 基因研究现状

MTHFR是叶酸与HCY 代谢中的重要酶，参与许多影响基因组稳定性、印迹以及表达的生理过程[42]。研究发现，哺乳动物MTHFR基因多态性，可诱导酶活性降低，造成DNA 甲基化异常，出现精子DNA 和膜损伤，影响精子发生过程，导致雄性不育[43,44]。近年来，研究人员先后在小鼠、人类以及家畜中检测出MTHFR基因的20 余种多态位点，其中C677T 位点广泛应用于不孕不育的研究，该位点已证实对男性精子发生具有显著影响，其他突变位点还有待进一步探究[45]。目前，在猪方面的研究多集中于多态位点与精液参数的相关性分析上。在长白猪的研究中，共检测到五个SNP 位点，分别为c.1278G ＞A、c.1041G＞A、c.570C＞T、c.414C＞G、c.450C＞T位点，相关性分析显示，前四个SNP 位点与其精子密度、精子畸形率以及精浆的MDA、H2O2呈显著性相关性，且c.450C＞T 位点与其精液量和精子密度显著相关，表明MTHFR基因在长白猪中的多态变异位点丰富，选择潜力大，不仅对其精液品质部分参数有显著相关性，同时也影响了公猪精浆中的氧化应激，这对研究其精浆内精子形态，增加精子密度和活力，改善精液质量存在重要提示，建议进行深入探究；在杜洛克猪中，共检测到两个SNP 位点，即c.450C ＞T 和c.294C＞T 位点，它们分别与杜洛克猪的精子密度、精子活力和总精子数、有效精子数显著相关，说明该基因在杜洛克猪体内同样存在突变位点，且对其精子的一些关键性参数指标具有显著影响，推测可一定程度上调节该猪种的繁殖性能；在大白猪中，检测到的突变位点与其精液品质均无显著性差异，影响效果不大，推测原因可能是该品种样本量不够或遗传特性不同所导致[46]。通过比对，发现在三个猪种中检测出的突变位点与NCBI 数据库公布的猪MTHFR基因SNP 位点（rs690512234）不一致，表明不同种猪均存在该基因变异位点，且具有DNA 遗传特异性，并对猪精液品质有一定影响。随后，研究发现MTHFR基因除了影响公猪精液品质，还与猪的骨骼发育、矿物质代谢以及形态特征有所关联，对猪的生长发育起到一定作用[47,48]。综上，表明MTHFR基因对公猪精液品质具有潜在调控作用，存在多个变异位点，可进一步影响其繁殖性能。目前该基因的研究主要聚焦在男性不育与基因多态性的关系，对种公猪精液品质的影响研究报道较少，其可作为公猪精液品质候选基因进行深入研究。

6 小结与展望

公猪精液品质在养猪业发展和猪品种改良中发挥重要作用，可直接影响后代的数量、质量以及养猪场经济效益。公猪育种的目的在于生产大量优质精液，将亲本的优良性状稳定地遗传给后代，但在实际生产中，公猪精液质量存在较大差异，这是制约养猪业发展的重要因素之一。目前，除了在公猪精液品质形态参数层面研究各个指标的变化，更重要的是从分子遗传学角度深度挖掘猪精液品质相关基因的研究和分子标记筛选，使其具有更高的精准性和生物安全性。因此，通过以上研究结果表明，AKAP3、HSF-1、WIP1、SPATA6和MTHFR基因能一定程度上影响种猪的精子活力、密度以及DNA 完整率等性能指标，具有正向调控作用，提示可作为种公猪精液品质候选基因进行分子遗传辅助标记。后续可结合现有科研成果，利用基因组编辑、酵母双杂交以及cDNA 文库构建等现代分子生物学技术，进一步探索公猪精液性状相关的遗传基因，开展基因功能验证，深度挖掘影响公猪精液质量的分子标记物，旨在更准确、快速地筛选出品质优良公猪精液，同时通过基因遗传修饰，进一步改善公猪精液质量，优化品种遗传特性，使其在遗传改良上发挥更大作用，为后续种公猪遗传育种研究提供有利依据。