一种可同时检测多效唑、三唑酮、三唑醇的胶体金试纸条研制及应用

◎ 付 辉，张美娟，王幸幸，覃冬梅，王炳志，杨星星

（1.深圳市易瑞生物技术股份有限公司，广东 深圳 518101；2.深圳市通量检测科技有限公司，广东 深圳 518038）

多效唑（Paclobutrazol，PBZ）是一种可提高作物产量的植物生长调节剂。三唑酮（Triadimefon，TIN）是一种效率高、有毒、残留量低、效果持久的三唑类杀菌剂。三唑醇（Triadimenol，TIL）是具有一定毒性杀菌剂，适用于防治麦类黑穗病、白粉病、锈病以及玉米、高粱等的丝黑穗病。目前常用的农药残留检测方法主要有液相色谱、气相色谱、液相色谱-质谱光谱分析和气相色谱-质谱。但这些技术需要昂贵的实验室仪器、训练有素的操作人员和特定的实验室环境。因此，建立一种简单、灵敏且有效的农产品中三唑类农药的检测方法迫在眉睫。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

XYZ3020 三维划膜喷金仪（杭州峰航科技有限公司）、DA-72AUTO 全自动切条机（BIODOT 有限公司）、智能数显恒温磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）、冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），相关抗原和抗体由深圳市易瑞生物技术股份有限公司自制。

1.2 实验方法

1.2.1 制备标记材料

称取100 mL 一级水于圆底烧瓶，置于磁力搅拌水浴锅中（100 ℃，700 r·min-1）搅拌加热至约100 ℃[1]。加入4 mL 1%氯金酸溶液，加热搅拌直至二次沸腾，迅速将4.6 mL 1%柠檬酸三钠加入沸腾后的溶液，8 min 后停止反应，搅拌至室温，转入干燥房中于4 ℃保存备用。

1.2.2 标记最适pH 值筛选

胶体金pH 的调节采用K2CO3溶液进行，用1 μg·mL-1的K2CO3溶液将6 mL 金标溶液的pH 分别调成6、7、8 和9，放置一段时间后添加100 μL 的10%牛血清蛋白溶液，离心后取上清进行吸光度测定来确定最佳pH 值[2]。

1.2.3 最适抗体标记浓度筛选

分别配制浓度为3 μg·mL-1和4 μg·mL-1的3 种抗体，与1 mL 制备好的金溶液振荡混匀，加入10%牛血清蛋白溶液共100 μL 进行封闭，静置1 min 后，离心30 min（12 000 r·min-1），弃上清后将沉淀用保存液重悬保存[3]。

1.2.4 抗原、二抗最适浓度筛选

T 线抗原浓度分别设置为1.2 mg·mL-1、0.9 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1和0.3 mg·mL-1，C 线二抗浓度始终固定为1.2 mg·mL-1，将不同浓度的抗原和二抗进行胶体金试纸条检测，最终确定最佳组合[4]。

1.2.5 制备胶体金标记抗体蛋白

用K2CO3溶液将胶体金调节至合适的pH 值，加入抗体，混匀后室温下静置反应10 min 标记。加入适量10%牛血清蛋白溶液对胶体金上未结合抗体的位点进行封闭，混匀30 s 后室温下静置反应15 min。封闭后离心15 min（4 ℃，12 000 r·min-1），弃去上清并加入一定体积的金子保护剂与金标复溶液进行重悬，得金标抗体溶液（湿金），并以一定体积分装于酶标微孔中，冷冻干燥后得到金标抗体（干金）。

1.2.6 制备试纸条

胶体金免疫层析试纸条由聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）底板、样品垫、硝酸纤维膜（Nitrocellulose Filter Membrane，NC 膜）和吸水垫组成。其中，NC 膜贴在PVC 底板的中部，用划膜仪将经过抗原稀释液稀释后的包被抗原和二抗喷涂固定在NC 膜上分别作为T 线与C 线，于37 ℃烘箱中过夜烘干[5]。样品垫经过样品垫处理液浸泡处理后于37 ℃过夜烘干，裁切后贴在底板的下端，覆盖NC 膜1 ～2 mm。吸水垫裁切后贴在底板的上端，覆盖NC 膜1 ～2 mm。最后用切条机切成4 mm 宽的试纸条，与干燥剂一起密封装入铝箔袋中，室温干燥保存，备用。

1.2.7 试纸条实用性检测

样品经过前处理后，吸取上层清液直接用试纸条进行样品检测。

1.2.8 试纸条特异性检测

取9 种PBZ、TIN 及TIL 结构类似物烯效唑、已唑醇、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇、双苯三唑醇、氟硅唑、丙环唑和苯醚甲环唑，每个样品测量3 次，观察是否与金标抗体有反应。

2 结果与分析

2.1 试纸条的条件优化

2.1.1 鉴定标记材料质量

本次研发中所自主制备的胶体金溶液呈紫红色，透明且澄清，无沉淀和絮状物，自主研发的金溶液质量好，其颗粒大小均一。

2.1.2 确定最适pH 值

随着pH 值的提高，通过图1 可知，当胶体金溶液的pH 值为8 时，阴性的T/C 比例最高，且阳性的T/C 最低，表明该浓度K2CO3下阴性的表现得更稳定，故确定pH=8 为PBZ、TIN 及TIL 的最适pH 值。

图1 pH 值对胶体金的影响图

2.1.3 确定最适抗体标记浓度

由表1 可知，PBZ 的抗体标记浓度为3 μg·mL-1时，浓度在3 ng·mL-1的标准品，T 线显色不明显，所以在3 ng·mL-1的标准品浓度下无法检出；当抗体浓度达到4 μg·mL-1，标准品浓度为3 ng·mL-1时，T 线不显色，则PBZ 可以检出，所以PBZ 的最适标记浓度为4 μg·mL-1，则PBZ 可选择最优抗体浓度为4 μg·mL-1，3 ng·mL-1为其最低检出限，同理可得，TIN 及TIL的最适抗体浓度标记分别为3 μg·mL-1、4 μg·mL-1，3 ng·mL-1及 6 ng·mL-1分别为TIN 和TIL 的最低检出限。综上，本实验PBZ 及TIL 的最优抗体浓度为4 μg·mL-1，TIN 最优抗体浓度为3 μg·mL-1。

表1 3 种抗体浓度试纸条的T 线、C 线显色统计表

2.1.4 抗原、二抗最适浓度筛选

随着抗原浓度的增加，标准线显色效果显著变弱；阴性试纸条的T 线显色信号随着抗原浓度的降低而升高，当抗原浓度为0.2 mg·mL-1时，表现出可接受的显色强度和最高的抑制率。因此，选择0.2 mg·mL-1作为检测线最佳抗原浓度；当纸条T 线浓度为0.2 mg·mL-1，C 线为1.2 mg·mL-1时，没有假阴出现，灵敏度好，故确定该条件为最适本实验条件。

2.2 样品前处理优化

在陶瓷的匀浆中加入9 g 样品（芹菜或韭菜）、乙腈5 mL、硫酸镁3 g 进行混合。将所得混合溶液加入大离心管中，剧烈摇晃一段时间，离心5 min（4 200 r·min-1）。取上清液在室温中氮吹至十分干燥。重悬在盐溶液中，得到芹菜或韭菜样品提取物用于试纸条检测样品溶液。

2.3 样品检测

移取样品液于小型酶标孔中，吹打、静置后全部转移至新的微孔，在加样后开始计时，3 min 反应结束后判读，超过15 min 为无效判读。对样品进行前处理后检测，样品重复检测3 次。图2 为PBZ、TIN 及TIL 的样品检测结果。

图2 PBZ（左一）、TIN（中间）及TIL（右一）的样品检测结果图

由图2 可知，随着待测样品加标品浓度的提升，T 线由强变弱，且均在5 ng·mL-1浓度，阳性T 线弱于阴性，达到检出标准，故待测样品加标品浓度分别为5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1均能检出，达到了《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763 2021）中三唑酮、三唑醇和多效唑在果蔬中的最低检测要求，为以后研发此类农药胶体金产品提供了前瞻性研究。

2.4 特异性检测

本研究选取9 种结构类似物烯效唑、已唑醇、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇、双苯三唑醇、氟硅唑、丙环唑和苯醚甲环唑，分别添加200 ng·mL-1标准品进行检测，如图3 结果显示T 线均显色且颜色较深，说明这几个药物与抗体没有交叉反应。

图3 特异性检测图（标准品浓度为200 ng·mL-1）

3 结论

建立了一种用于农产品中PBZ、TIN 及TIL 的检测。采用快速、廉价、有效的QuEChERS 方法对样品进行预处理前处理优化，研发了检测PBZ、TIN及TIL 的试纸条，该试纸条成本更低，特异性好，检测后3 ～8 min 就能够进行视觉检测，符合《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763 2021）的相关要求，因此非常适合在大批量的现场快速筛查中推广使用。