一种酶系缺陷型酱用曲种的筛选、扩培及应用

◎ 陈 执

（广东美味鲜调味食品有限公司，广东 中山 528400）

黄豆酱是我国传统的调味酱，通常是以黄豆、面粉为原料，将黄豆炒熟磨碎后经过米曲霉等微生物发酵而制成的一种更容易被人体消化吸收的半流动状态的发酵调味食品。现有的黄豆酱在生产及贮藏过程中，经常出现形状不规则的白色结晶，俗称白点，并且随着黄豆酱商品货架期的延长，白点还会有增多的趋势，严重影响黄豆酱成品的外观。因此，黄豆酱白点问题成为行业亟待解决的难题。

黄豆酱酿造用主力菌种为米曲霉，其在制曲过程中分泌大量的蛋白质水解酶系，大豆蛋白在蛋白酶的作用下水解成小分子肽，进而分解为多种氨基酸和少量短肽，其中含有酪氨酸末端的肽链会在酪氨酸羧肽酶的作用下生成酪氨酸。因游离的酪氨酸难溶于水，当酪氨酸超出水的溶解度时就会先析出微小的晶核，随着蛋白质水解酶系的催化和水解，释放出更多的酪氨酸，使析出的晶体逐渐增大，累积形成肉眼可见的白点。本文通过筛选产游离酪氨酸肽酶的缺陷型菌株，降低黄豆酱发酵过程中游离酪氨酸含量，进而抑制白点的析出。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

酿造黄豆酱生产原料黄豆、面粉、食盐从市场采购；米曲霉As3.951，由广东美味鲜调味食品有限公司提供。

超净工作台、培养箱、种曲机、NK 式旋转蒸煮锅、发酵池和60 m3发酵罐等。

1.2 方法

1.2.1 酶系缺陷型酱用菌株的筛选

从菌种库中选取20 株不同的米曲霉菌株，以黄豆酱常用曲精为对照组，将20 株米曲霉试管菌种转接三角瓶中，35 ℃培养72 h。取1 g 三角瓶菌种，加99 g面粉，混合均匀，制作成菌种粉，再将100 g 熟豆、10 g 面粉和8 g 菌种粉置于1 L 三角瓶中，混合均匀，放置在湿度为100%、温度为35 ℃培养箱中，充分吸附面粉，最后将充分吸附面粉的黄豆，放在湿度为100%、温度为30 ℃培养箱培养44 h[1]。大曲成熟后，送检大曲的中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力[2-3]，选取其中中性蛋白酶活力明显低于酸性蛋白酶活力的大曲作为目标菌种，跟进游离酪氨酸指标。

1.2.2 酶系缺陷型酱用菌株发酵关键参数的验证

将上述20 株成熟大曲充分摇散，称重。与306 g浓度为25%的盐水混合，补水至600 g，制成酱醪，在培养箱中30 ℃发酵10 d，每天搅拌，发酵完成后，送检酱豆的游离酪氨酸、生酱油理化指标，确认上述目标菌种的游离酪氨酸指标是否明显低于其他菌株[4]。其中，筛选出中性蛋白酶活力明显低于酸性蛋白酶活力，且游离酪氨酸指标较低的菌种作为酶系缺陷型酱用菌种，进入中、大试验证。

1.2.3 米曲霉中、大试降酪氨酸效果验证试验

（1）种曲培养基制作。选用干净无杂质的麸皮，按麸皮∶水∶面粉=1 ∶1 ∶0.2 的配方，将麸皮加至拌料机内，加入对应比例的自来水，搅拌1 min，停机。润水5 min 后，均匀撒入相应比例的面粉，搅拌2 min，倒出，均匀铺于曲盘中，送入种曲机内，121 ℃灭菌30 min。

（2）种曲培养。灭菌好的培养基，接种筛选出的酶系缺陷型酱用菌种，接种量5‰。接种后，按以下工艺进行种曲扩大培养。①0 ～30 min 只开风机，风机频率30 Hz，30 min 后关闭风机。②0.5 ～6.0 h 打开罐体排污阀，一直通气，通气量为6 m3·h-1，控制料温为30 ～34 ℃。③6 ～14 h 加湿10 min·h-1（隔一小时加湿10 min，下同），一直通气，通气量为6 m3·h-1，料温为30 ～34 ℃。④14 ～18 h 加湿10 min·h-1，一直通气，通气量为10 m3·h-1，料温为30 ～34 ℃。⑤18 ～46 h，连续通气、加湿，通气量为10 m³·h-1，控制料温为30 ～34 ℃。⑥46 ～54 h 加湿30 min·h-1，连续通气，通气量8 m³·h-1，料温为30 ～34 ℃。⑦60 ～72 h，连续通气，通气量6 m³·h-1，料温28 ～30 ℃，培养种曲72 h 得到成熟的种曲。送检培养成熟的种曲，测定其中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力。

1.2.4 酶系缺陷型酱用菌株降酪氨酸效果验证

筛选出低产酪氨酸的米曲霉，与黄豆、面粉进行混合制曲，接种量为5‰，制曲时间为42 ～44 h；送检成熟大曲的中性和酸性蛋白酶活力；成熟大曲与17 Bé 的盐水按照1 ∶2.5 的比例制醪，发酵罐进行晒露发酵[5-6]，以黄豆酱常用大曲S1 为对照，按生产规模验证菌株降酪氨酸的效果。

1.2.5 指标测定方法

酱豆中的中、酸性蛋白酶的活力按《蛋白酶活力测定法》（SB/T 10317 1999）测定；总酸按《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》（GB 12456 2021）测定；氨基酸态氮按《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》（GB 5009.235 2016）测定；酪氨酸按《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124 2016）测定；盐分按《酱油卫生标准的分析方法》（GB 5009.39 2003）测定。

2 结果与分析

2.1 酶系缺陷型酱用菌株的筛选

由表1 可知，本轮共筛选了菌种库中的20 株米曲霉菌株，与对照菌种（曲精）相比，米曲霉菌株M13的中性蛋白酶活低于对照菌株，酸性蛋白酶活略高于对照菌株，且酸性蛋白酶活力远远高于中性蛋白酶活[7-8]。由表2 可知，M13 菌株酿造酱胚的游离酪氨酸生成率远低于对照菌种，且氨基酸态氮亦可满足黄豆酱的需求，将该菌株进行大试效果验证。

表1 大曲中性和酸性蛋白酶活力表 单位：U·g-1

表2 生酱油理化及酱豆游离酪氨酸表

2.2 酶系缺陷型酱用菌株大试规模性能验证结果

由表3 和表4 可知，筛选出的米曲霉M13 菌株制得大曲的中性蛋白酶活力远低于对照组。将其成熟大曲按照黄豆酱发酵工艺进行发酵，检测不同发酵时间酱胚的理化指标及游离酪氨酸含量可知，发酵60 d 酱胚中的游离酪氨酸含量为38 mg/100 mL，远低于黄豆酱白点析出的警戒线（内部试验多次验证结果为100 mg/100 mL），大大降低了产生白点的风险，该菌株能稳定降低酱豆中游离酪氨酸。

表3 目标菌株和对照菌种制得大曲的中性和酸性蛋白酶活力对比表 单位：U·g-1

表4 发酵不同时间对照样和试验样酱胚的理化指标对比表

3 结论

从菌种库中筛选出低中性蛋白酶活、低游离酪氨酸产率的酶系缺陷型米曲霉菌株，经黄豆酱发酵确定了低游离酪氨酸产率的酶系缺陷型的米曲霉菌株的应用效果，该菌株能满足酱豆中低产酪氨酸的需求、性能稳定。