线粒体功能障碍与射血分数保留型心力衰竭的研究进展

江克兵 吴青青 沈涤非

心力衰竭(heart failure,HF)是心脏泵血能力下降导致全身器官灌注不足而引起的临床综合征,运动耐力下降和劳力性呼吸困难为心力衰竭的典型症状。HF是老年人死亡的主要原因之一,根据中国心力衰竭流行病学调查显示,我国 35 岁以上人群HF的患病率约为0.9%[1]。且临床上射血分数保留型心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)已成为HF的主要表现形式,据统计HFpEF约占心力衰竭的50%,而且随着人口老龄化和生活方式的改变,HFpEF的患病率将进一步增加。HFpEF是以心室壁增厚、左心室顺应性降低、心脏舒张功能障碍和运动耐力下降为特征的临床综合征。静息状态下HFpEF患者心脏射血分数尚可维持,不影响心肌功能;在运动状态下,HFpEF患者无法协调呼吸系统、心脏泵和外周循环系统,将氧气运送至骨骼肌和心肌的线粒体中合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),为机体提供能量。研究表明,HFpEF患者的运动氧耗量峰值(Peak VO2)持续性下降,致使运动期间ATP生成率和磷酸肌酸(creatine phosphate,PCr)再合成率显著降低,无法维持正常生理代偿[2]。根据Fick方程,Peak VO2等于心排出量与动静脉氧差(arteriovenous oxygen difference,A-VO2Diff)的乘积,A-VO2Diff是组织提取氧气的标志,因此HFpEF患者运动期间能量产生不足可能是心排出量减少和组织氧气利用减少共同导致的结果。近年来研究也证实,运动过程中心排出量减少仅占HFpEF氧耗量峰值减少的50%,组织对氧气利用减少则占另一半[3,4]。组织利用氧气主要方式为线粒体氧化磷酸化,线粒体功能稳定是维持其氧化磷酸化能力的基础,因此线粒体功能障碍与HFpEF的发生、发展密切相关。

一、线粒体功能概述

线粒体是哺乳动物细胞能量产生的重要场所。多分布于肌原纤维之间,与肌节平行地从一个Z带延伸到另一个Z带,约占心肌细胞体积的45%。心脏作为动力器官,需要大量能量维持心脏泵出血液以维持全身氧供。心肌细胞产生的ATP约95%来源于线粒体,其余部分来源于糖酵解和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)形式[5]。因此线粒体功能稳定对能量的产生及利用至关重要,线粒体具有自身质量控制系统以维持线粒体功能的稳定。即线粒体能进行有序的生物发生、融合、分裂和自噬。在这些机制的共同作用下,线粒体降解和补充达到平衡,确保存在足够数量的功能性线粒体来维持机体的能量需求[6]。

1.线粒体生物发生：线粒体生物发生是改变线粒体大小和增加其数量以提高ATP产生能力的过程。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子 1α(peroxisomal proliferator-activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)是目前广泛认可的线粒体生物发生调节因子,通过激活不同的转录因子诱导线粒体生物发生,包括过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)、核呼 吸 因 子(nuclear respiratory factors,NRFs)、雌激素相关受体(estrogen related receptor,ERRs)等,进一步激活线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,Tfam)的表达,驱动线粒体DNA(mtDNA)的转录和翻译。此外,PGC-1α可通过NRF-1诱导核基因组表达生成核编码线粒体蛋白(nuclear-encoded mitochondrial proteins,NEMP),NEMP以未折叠构象通过蛋白质易位酶穿过线粒体内外膜进入线粒体,随后在基质蛋白酶的作用下水解前序部分,并在分子伴侣的帮助下折叠成熟[7]。

2.线粒体分裂与融合：线粒体通过改变其形态和分布以适应不同组织器官的生理活动和环境,最突出的特征是线粒体分裂与融合。介导线粒体分裂与融合的核心蛋白是膜重塑机械化学酶,属于GTP酶动力蛋白家族。线粒体动力蛋白包括动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、丝裂蛋白(mitofusin,Mfn)和视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)[8]。线粒体分裂主要受Drp1调控,Drp1为胞质蛋白,通过与线粒体外膜锚定受体蛋白结合被募集到线粒体-内质网接触位点,水解GTP驱动线粒体收缩,使线粒体形态改变或分裂。Drp1主要受体为线粒体裂变因子(mitochondrial fission factor,Mff)和线粒体动力蛋白(mitochondrial dynamics proteins,MiDs),Mff 募集功能活跃的寡聚Drp1,诱导线粒体收缩分裂;而无活性的二聚体Drp1则与MiDs 结合,诱导线粒体延长[5]。线粒体外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)和内膜(inner mitochondrial membrane,IMM)的融合则分别受Mfn和OPA1的调控。Mfn包含G结构域、TM螺旋和两个中心螺旋区(HB1和HB2)。Mfn通过TM螺旋锚定在OMM上,G结构域能结合并水解GTP为线粒体融合提供能量。首先G结构域之间结合形成二聚体,随后Mfn借助G结构域结合形成的铰链相互移动将两个OMM拉近融合。当两个OMM融合后,IMM会快速融合,这个过程由OPA1介导。OPA1包含与N端紧邻的G结构域、与脂质相互作用的茎(LIS)和两个中心螺旋区(BSE和stalk)。IMM的融合需要利用各分子间的相互作用,主要为G-BSE-stalk模式介导的“头对尾”组装诱导膜弯曲,在两个 IMM 上产生不稳定尖端。当两个不稳定尖端相遇时,产生一个融合孔,通过扩大融合孔完成IMM的融合[9]。

3.线粒体自噬：线粒体自噬可以清除多余、老化和受损的线粒体,维持线粒体功能和线粒体蛋白质量。受损线粒体被识别、分离,随后与溶酶体结合形成自噬溶酶体,最终降解。线粒体自噬包括泛素依赖性微管相关蛋白1轻链 3(microtubule associated protein 1 light chain3,LC3)适配体蛋白途径、非泛素依赖性LC3适配体蛋白途径和LC3受体直接作用途径[10]。泛素依赖性LC3适配体蛋白途径主要为PTEN诱导假定激酶1(pten induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligase,PARKIN)介导的线粒体自噬,是哺乳动物受损线粒体最常见的自噬途径。线粒体损伤导致线粒体膜电位去极化、PINK1分裂减少,PINK1通过外膜转位酶(outer membrane translocase,TOM)聚集在受损线粒体外膜,随后发生自身磷酸化并激活。激活后的PINK1可招募PARKIN并将其磷酸化激活,激活后的PARKIN使线粒体膜上底物蛋白多聚泛素化,随后被LC3适配体识别,与 LC3 结合介导线粒体进入自噬体,再与溶酶体结合,形成自噬-溶酶体,降解受损线粒体[6]。非泛素依赖性LC3适配体蛋白介导的线粒体自噬,主要为胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase,CHDH)、TBC1结构域家族成员15(TBC1 domain family member 15,TBC1D15)等线粒体蛋白通过LC3适配体与LC3结合,介导受损线粒体自噬降解[11]。除了依赖线粒体LC3适配体蛋白的自噬途径外,还有一类线粒体蛋白可以直接与LC3结合,介导受损线粒体自噬,包括位于OMM的BCL相互作用蛋白3(Bcl-2 interacting protein 3,BNIP3)、含 FUN14 域蛋白 1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)、Bcl-2样蛋白13(Bcl-2-like protein 13,BCL2L13)、FKBP脯氨酰异构酶8 (FKBP prolyl isomerase 8,FKBP8)和位于IMM的抑制素2(prohibitin 2,PHB2)、心磷脂(cardiolipin)等。

二、线粒体功能障碍在HFpEF中的作用

线粒体氧化磷酸化合成ATP同时伴随着副产物活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生。ROS在线粒体中积累导致线粒体损伤、功能障碍,加重心力衰竭患者能量产生与需求的失衡,并激活下游与心脏重塑、炎症和舒张功能障碍相关的信号通路[12]。Hahn等[13]研究发现,在HFpEF中参与ATP合成、电子传递链的基因被上调,而这些通路在射血分数减少型心力衰竭(heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF)中被下调;此外,相比HFrEF,参与内质网应激、线粒体自噬、血管生成、一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的基因在HFpEF中表达下降。

1.线粒体氧化应激在HFpEF中的作用：ROS产生和防御清除之间平衡失调所致氧化应激是线粒体损伤的常见原因。多种机制参与调节氧化应激和维持氧化还原稳态,包括炎症、ROS和NO的表达水平。Schiattarella等[14]研究发现,HFpEF导致冠状动脉内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性降低、NO合成减少。而与eNOS活性降低相反,HFpEF时诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性增加。iNOS可以使多种蛋白质内的半胱氨酸残基亚硝基化,干扰蛋白质功能[15]。除此之外,HFpEF时心肌细胞线粒体内的NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase subunit 4,NOX4)表达也增加,导致线粒体中超氧化物和过氧化氢两种ROS合成增加。上述研究表明,HFpEF时心肌细胞对NO的生物利用率降低、ROS产生水平升高。并且ROS增多导致肌联蛋白(titin)形成二硫键;同时NO减少也使蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)活性降低、肌联蛋白磷酸化降低。两者共同诱导肌联蛋白僵化,使心肌细胞失去弹性、心室顺应性下降[16]。此外氧化应激时可通过激活线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)改变线粒体通透性,开放mPTP使线粒体基质内和胞浆内的离子得以平衡流动,驱散线粒体内膜跨膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm),使线粒体膜电位去极化,线粒体发生肿胀、破裂和功能障碍;mPTP的开放,还使线粒体内外膜间和基质之间的质子浓度梯度消失,导致线粒体氧化磷酸化和ATP产生解偶联[17]。

2.线粒体生物发生在HFpEF中的作用：Chaanine等[18]研究发现,HFpEF患者心肌细胞线粒体生物发生标志物PGC-1α表达降低,mtDNA转录和复制下降,而线粒体分裂标志物Drp1的表达并不增加[5]。此外有研究表明,心力衰竭时由于ROS产生增加激活共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated protein,ATM)介导的 DNA 损伤反应途径,诱导核糖核蛋白结构域家族成员7(laribonucleoprotein domain family member 7,LARP7)泛素化和降解,导致线粒体生物发生受损,线粒体合成缺陷;同时降低沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的稳定性和去乙酰化酶的活性,损害由SIRT1介导的氧化磷酸化和能量代谢基因的转录[19]。以上研究表明,HFpEF时氧化应激引起线粒体损伤,而线粒体生物发生被抑制,代偿性线粒体生物发生调节失调,新生线粒体不足。

3.线粒体分裂、融合在HFpEF中的作用：Molina等[20]研究发现,HFpEF患者MFN2表达明显降低,且MFN2表达降低与HFpEF患者的运动不耐受、Peak VO2下降存在明显的正相关。研究证实,慢性心力衰竭时下调Drp1的表达,抑制受损线粒体的裂解与自噬,导致受损线粒体积累、线粒体功能障碍[21]。此外当心肌肥厚心肌收缩力增强、心肌细胞需求更多能量时,虽然线粒体数目增加,但线粒体体积减小,嵴结构被破坏。而调节线粒体分裂的关键因子Drp1和调节线粒体融合的关键因子Mfn1/2、Opa1并没有被激活;调节线粒体生物发生的关键因子PGC-1α和NRF1的转录水平也未增加[22]。与HFpEF比较,在HFrEF中,线粒体生物发生标志物PGC-1α表达同样降低,但线粒体分裂标志物Drp1表达增加。这些研究结果表明,HFpEF时线粒体分裂与融合的能力被抑制,线粒体周转率下降,无法及时调整线粒体形态与分布、满足心肌细胞对能量的需求。

4.线粒体自噬在HFpEF中的作用：HFpEF是由于心室壁增厚、冠状微动脉稀疏、氧气扩散和转运能力降低,导致心脏氧供不足。脂肪酸氧化相比葡萄糖、乳酸和酮体氧化需要更多的氧气,因此心脏代谢由脂肪酸氧化向葡萄糖和酮体氧化转变[23,24]。Dan等[25]研究发现,当长期的脂肪酸氧化减少时,脂肪酸供应、储存和利用失衡,心肌细胞中中性脂肪酸积累,脂肪毒性增加使线粒体损伤。此时由PINK1/parkin介导的线粒体自噬被抑制。受损线粒体无法降解,受损线粒体积累,线粒体出现形态改变和异质性,最终导致心肌细胞损伤、心脏收缩和舒张功能障碍。相反通过促进小鼠心肌细胞中PINK1/parkin介导的线粒体自噬途径可以对心肌细胞起到保护作用。但有趣的是,也有研究发现,HFpEF患者心肌细胞中,由叉头框转录因子O3a (forkhead transcription factor O subfamily member 3a,FOXO3a)/BNIP3介导的线粒体自噬途径是被激活的,促进受损线粒体自噬降解。上述研究显示,在HFpEF发生、发展中对线粒体自噬功能可能会产生不同影响,这些差异可能是由于调控线粒体自噬的信号机制不同或疾病不同发展阶段所致,其具体机制仍需进一步深入研究。

三、纠正线粒体功能障碍的方向及相关药物

1.抗氧化剂：此类药物可减轻线粒体功能障碍时ROS增加所致的细胞毒性作用。包括维生素C、维生素E、硫辛酸和半胱氨酸供体等。硫辛酸是丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex,PDH)和酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-OGDH)等线粒体多酶复合物的必需因子,在能量代谢中起关键作用。其次,硫辛酸及其还原形式二氢硫辛酸具有高电子密度和还原电位,是一种有效的抗氧化剂,能清除各种ROS。谷胱甘肽是一种细胞内抗氧化剂,其合成受半胱氨酸的影响。通过补充半胱氨酸供体可增加谷胱甘肽水平,从而增强机体清除ROS的能力。在一项随机、双盲、安慰剂对照实验中表明,使用肌酸、辅酶Q10和硫辛酸的联合治疗可降低线粒体疾病患者血浆中的乳酸和尿液中的氧化应激标志物含量。此外,有研究表明,使用硫辛酸和维生素E治疗能改善阿托伐他汀诱导的大鼠线粒体功能障碍。

2.恢复一氧化氮的产生：越来越多证据表明,线粒体功能障碍患者存在NO缺乏症,NO是精氨酸在NOS作用下产生的。精氨酸的来源有3个途径：膳食摄入、蛋白质分解和从头合成。精氨酸的从头合成是由瓜氨酸在精氨酸琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase,ASS)和精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)的作用下合成的。因此,精氨酸和瓜氨酸都是NO合成的前体物质,通过补充外源性精氨酸和瓜氨酸可用于治疗线粒体功能障碍时NO合成减少。有研究表明,在多种线粒体疾病的患者血浆中都检测到精氨酸和瓜氨酸水平降低,并且给予MELAS综合征患者静脉注射精氨酸治疗,可改善脑卒中发作期的临床症状、降低脑卒中样发作的发作频率和严重程度。

3.增强线粒体生物发生：此类药物通过增加线粒体生物发生以增加线粒体数量,缓解线粒体功能障碍所致ATP缺乏。包括苯扎贝特、表儿茶素和 RTA 408等。苯扎贝特是一种 PPAR 激动剂,通过激活PPAR/PCG-1α通路诱导线粒体生物合成。在细胞色素c氧化酶缺乏小鼠模型中,苯扎贝特可激活线粒体生物合成,从而增加线粒体数量、氧化磷酸化能力和能量产生。表儿茶素是一种含有多个酚羟基结构的黄烷类化合物,容易被氧化成醌类而提供氢离子,具有显著的抗氧化作用。此外有研究表明,给小鼠喂食表儿茶素能增强线粒体生物发生,增加电子传递链蛋白、mitofilin蛋白、孔蛋白和Tfam的表达。RTA 408是一种人工合成异戊二烯,可通过激活Nrf2增强线粒体生物发生。

四、展 望

线粒体在心肌能量代谢发挥重要作用。HFpEF发生时ROS积累诱导氧化应激致线粒体功能障碍,使患者能量产生与需求失衡。通过药物增强线粒体功能,能对某些线粒体疾病起到有益效果。此外近年来有研究发现,通过1年高强度运动训练可改善左心室肥大患者线粒体功能,降低HFpEF的风险。因此,准确评估和有效改善线粒体功能,不仅有助于深入阐明HFpEF的病理生理机制,也为HFpEF的临床治疗提供新的靶点。