自噬在低氧性肺动脉高压中的研究进展

陆嘉欣 吴 旭 蒋永亮

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一种严重的进展性综合征,会使肺血管阻力上升甚至右心衰竭,最终导致死亡。目前其病理机制包括血管收缩、血管重构、血栓形成和炎症等关键因素。虽已有众多研究针对HPH,但其病因仍未完全明确,阐明HPH的发病机制十分迫切和必要。

自噬可降解受损或不需要的细胞成分进行自我更新,在特定环境下对宿主有保护功能,自噬-溶酶体途径通过降解蛋白质聚集体或受损的细胞器维持细胞生长调节等活动以发挥促生存作用,但同时自噬功能受损也可转变为促死亡因素。随着对自噬的深入探索,研究自噬在HPH的调控机制有望成为HPH治疗靶点。

自噬过程涉及一系列分子事件,包括膜的启动、成核、延长和闭合。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可直接参与调控自噬。自噬关键蛋白Atg6(autophagy 6/Beciln1)是自噬过程中一个重要调节因子,其作为Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)复合物的主要部分调节自噬小体形成。Ⅲ类PI3K复合物和Atg38与质膜结合,催化磷脂酰肌醇转化为磷脂酰肌醇3-磷酸,从而招募与磷脂酰肌醇3-磷酸结合的蛋白[1]。

一、细胞自噬通路

1.PI3K/Akt/mTOR通路：PI3K以二聚体形式存在,由调节亚基p85和催化亚基p110组成。当外部刺激因子信号转导至细胞后,p85结构改变使PI3K正式启动,同时激活其下游信号分子蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)从胞质转移至质膜上成为p-Akt,p-Akt将信号转导到mTOR,mTOR激活泛素蛋白酶体途径并调节自噬相关基因或其他下游底物,以发挥抑制自噬的生理效应。

2.FoxO1通路：转录因子叉头框蛋白O1(forkhead box O1,FoxO1)通路可激活自噬。在应激状态下FoxO1与沉默信息调节因子1结合物分离后出现的形式为活化状态的乙酰化FoxO1,此状态下FoxO1在细胞质内与Atg7特异性结合激活细胞自噬[2]。而PI3K/Akt信号通路可使FoxO1磷酸化,磷酸化后FoxO1从细胞核转运至细胞质,失去调节其目标基因的能力而抑制自噬。

3.BMPR2通路：骨形态发生蛋白受体2(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)拮抗剂noggin可减少腺泡细胞中空泡形成,下调微管相关蛋白1B-轻链3(microtubule-associated protein 1B light chain 3 beta,LC3B)水平,即BMPR2通路可促进自噬发生[3]。但同时自噬的上调可加重缺氧诱导的BMPR2功能障碍,进一步说明该通路与自噬存在相互影响甚至负反馈调节的潜在机制可能。自噬和BMPR2之间的联系还可能存在于其他细胞信号通路中,因为自噬和BMPR2都参与β-catenin等信号通路。

4.MAPK信号通路：细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶 (c Jun N terminal kinase,JNK)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38 MAPK)是MAPK的主要通路,以上通路皆可调节细胞自噬。JNK1正向调控自噬的机制如下：一方面,JNK1介导抗凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)磷酸化干扰其与Beclin1的结合,Beclin1表达上调促进自噬发生。另一方面,JNK1可增强损伤调节自噬调控基因(damage-regulated autophagy modulator,DRAM)的表达,从而使DRAM刺激Beclin1释放以诱导自噬的发生[4]。马乾等[5]在肺成纤维细胞中验证补肾益肺消癥方机制之一可能是抑制JNK/p62(sequestosome 1)/Parkin通路减缓细胞线粒体自噬进程。ERK5可直接磷酸化unc-51样激酶1(unc-51-like kinase 1,ULK1)来下调自噬,ERK5抑制自噬通量不依赖腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和mTOR,而与内质网未折叠蛋白反应激活有关。p38 MAPK在自噬中为双向调节因子,血红素加氧酶-1抑制剂通过激活p38 MAPK途径诱导Beclin1非依赖性自噬,而p38 MAPK活化还可诱导ULK1磷酸化,其破坏ULK1-Atg13复合物导致自噬减弱,这一过程存在Atg5蛋白的干预[6]。以上证明p38 MAPK通路通过激活下游不同信号分子在自噬调控中具有双重作用。

5.NF-κB通路：核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路与自噬之间的联系非常复杂,其可经多种途径参与自噬活动。死亡相关蛋白激酶1通过下游p38 MAPK/NF-κB途径触发炎性反应和自噬,共同导致肺损伤。与之相反的是二氧化硅纳米粒子通过p62/NF-κB途径可引起肺组织中的自噬功能障碍,NF-κB抑制剂BAY11-7821可通过激活自噬抑制胶质瘤细胞异常增殖[7,8]。同时研究发现,不同蛋白质聚集应激可经非典型途径激活NF-κB,诱导自噬过程[9]。以上提示NF-κB可通过多种途径参与自噬发生,并双向调节其功能。

二、自噬在低氧肺动脉高压中的作用

现有研究表明,自噬在肺血管细胞中的活动对HPH发生、发展具有双重调控机制。Lee 等[10]验证缺氧诱导肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)的小鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCS)及内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells,PAECS)中LC3B、Beclin1表达增加,同时实验表明,血管细胞中活跃的LC3B可能部分抑制血管重塑的增殖过程,首次证实自噬对HPH调控具有双面性。在HPH大鼠模型中,荜茇酰胺治疗后PASMCS和大鼠肺组织中LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高,荜茇酰胺增加了PASMCS自噬通量,显著抑制缺氧诱导的PASMCS增殖,提示自噬在肺血管重构中起保护作用[11]。而葛根素通过抑制自噬减轻缺氧诱导的肺血管细胞周期进展和增殖,其可逆转缺氧引起的PASMCS进入S期的增加,并使细胞停滞于G1期,提示自噬在肺血管重构中可为推动因素[12]。这意味着自噬在HPH中存在完全相反作用,明确自噬相关通路在HPH中作用可为其治疗提供未来新方向。

1.mTOR、NF-κB通路双向调节低氧性肺动脉高压形成：mTOR复合物1(mTORC1)和 mTOR 复合物 2(mTORC2)为mTOR两类不同的蛋白激酶复合物。低氧条件下可激活二者,mTORC1抑制对营养敏感的自噬,而mTORC2可能对分子伴侣介导的自噬存在特异性,二者通过抑制自噬调控血管生成和细胞增殖：在缺氧条件下mTORC1具有早期激活和晚期抑制细胞增殖作用,而mTORC2则为延迟和维持的激活细胞增殖作用。实验验证抑制mTORC1可减轻PH,而抑制mTORC2可引起自发性PH,使用mTOR抑制剂和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)受体抑制剂可显著延缓HPH[13]。这可能与mTORC1主要调控与肺血管重构关系紧密的巨自噬,而mTORC2则主要影响细胞存活和细胞骨架重塑,抑制mTORC2通路激活自噬更易受其他因素干扰影响其对肺血管细胞的保护作用有关。Yes相关蛋白表达下调可降低自身核定位,从而下调PI3K表达,抑制PDGF-BB诱导的Akt磷酸化激活自噬,改善肺血管重构和右心室肥大。某些药物如槲皮素、白藜芦醇均可在HPH大鼠模型中干扰PI3K活性,通过下调PI3K/Akt/mTOR通路增强自噬,抑制PASMCS增殖[14]。这些研究表明,自噬激活可发挥抗增殖效果,自噬诱导剂对防止肺血管重构有潜在作用。

而与之结论相反的是,Li等[15]发现Galectin-3蛋白可通过抑制瞬时受体电位通道(transient receptor potential canonical TRPC)1/4途径和激活Akt/mTOR通路,抑制自噬最终抑制PAECS的增殖。爱帕琳肽通过激活mTOR通路抑制缺氧诱导的自噬来缓解大鼠PASMCS增殖和迁移,17β-雌二醇可上调爱帕琳肽来减轻PH诱导的右心室衰竭[16]。达可替尼通过mTOR通路抑制缺氧诱导的PASMCS细胞周期进程、增殖、迁移和自噬,减弱PASMCS从G0/G1期进入S期的进程,抑制肺动脉血管重构[17]。目前达可替尼对HPH的治疗仍处于临床试验阶段。

以上研究表明,mTOR通路可双向调控HPH的形成,这意味两个mTOR复合体的信号不仅在肺血管细胞对缺氧的反应中存在协同机制,还可能受其他因素影响。以mTOR抑制剂或mTOR激活剂为基药的联合治疗可能提供基于重要通路机制的治疗HPH新方向。

NF-κB在HPH中也是调控肺血管重构的重要原因,该通路可诱导自噬激活,进而下调Rho家族GTP酶3表达,促进HPH发展。同时低氧诱导NF-κB激活后上调PASMCS中细胞周期蛋白D1表达,导致细胞周期G1向S期转变,从而促进PASMCS增殖。激活AMPK可抑制NF-κB的p65亚基从胞质到胞核的移位,降低PH中自噬标志物蛋白水平。AMPK激动剂二甲双胍抑制NF-κB介导的自噬激活,从而降低野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的PH的右心室收缩压,首次揭示二甲双胍抑制自噬和逆转肺血管重塑的新机制[18]。而缺氧后PAECS中NF-κB表达增加,给予NF-κB抑制剂后缺氧诱导的Galectin-3蛋白下调,而Galectin-3下调可增加LC3B表达,上调 TRPC1/4和钙蛋白酶的信使RNA和蛋白水平从而促进自噬,提示NF-κB可抑制自噬以促进HPH发生[19]。同时NF-κB受体激动剂可抑制PASMCS Atg5/Atg7/Beclin1/LC3依赖的自噬途径,从而减轻肺血管重构和功能障碍,提示该通路可抑制自噬以达到缓解HPH[20]。这表明NF-κB不仅可双向调节自噬,还对肺动脉血管细胞增殖具有双面调控机制,其涉及的下游信号通路仍需进一步探究。

2.低氧条件下抑制低氧性肺动脉高压形成的自噬相关通路：FoxO1通路由FoxO1诱导recombinant sestrin 3 (SESN3)蛋白表达上调形成FoxO1-SENS3-mTOR,该通路使下游mTOR被抑制而自噬激活,最终减弱PASMCS增殖从而延缓HPH。吡非尼酮目前已用于特发性肺纤维化治疗,研究证实在缺氧大鼠模型中,吡非尼酮剂量依赖地增加FoxO1水平及其核转位,从而减弱PASMCS增殖和迁移能力,这意味着已投入临床使用的吡非尼酮有望以抑制FoxO1为靶点机制激活自噬抑制HPH的形成,实现老药新用这一扩展用药[21]。而在MCT诱导大鼠PH模型中胞质内FoxO1升高可刺激自噬激活,紫杉醇通过抑制FoxO1介导的自噬,最终降低PH,提示FoxO1介导的自噬可促进肺血管重塑[22]。这也表明在非低氧诱导的PH动物模型下,FoxO1通路激活自噬后可能对肺血管重构产生相反作用。

BMPR2突变及介导信号的紊乱是HPH易感因素之一。SIN3转录调控蛋白家族成员A过表达后可阻断BMPR2启动子区域的甲基化上调BMPR2表达,最终抑制PASMCS增殖[23]。PAECS中上调BMPR2可逆转低氧诱导的大鼠PH[24]。内皮-间质转化(endothelial to mesenchymal transition,ENDMT)被认为是肺动脉重构重要因素,而BMPR2可抑制ENDMT。Liu等[25]在人PAECS证明miRNA-204下调后促进自噬以减弱缺氧诱导的ENDMT,其中BMPR2表达上调,在一定程度上改善HPH,以上提示BMPR2通路或可通过抑制ENDMT促进自噬以抑制肺动脉血管重构。低氧促有丝分裂因子诱导的PH中,高迁移率族蛋白-1信号下调BMPR2以抑制自噬,协同增强肺血管细胞增殖,同时实验验证低氧抑制的FoxO1可能是自噬和BMPR2下调之间联系的一种机制,FoxO1、BMPR2这两条通路可能通过某一共同靶点激活自噬,从而对HPH形成起抑制作用[26]。

3.低氧条件下促进低氧性肺动脉高压形成的自噬相关通路：JNK通路除可使Beclin1游离后形成PI3K复合物促进自噬,还能介导自噬研究相关基因表达上调激活自噬。JNK可作为Toll样受体-9下游效应分子参与调控缺氧时PASMCS增殖,使用JNK抑制剂可减少其磷酸化,降低该细胞增殖水平[27]。缺氧通过激活ERK、JNK和p38信号通路促进细胞增殖和抑制PASMCS凋亡,进而诱导肺血管重构。Guo等[28]实验证明,在体内沉默recombinant notch homolog4(Notch4)重组蛋白可通过Notch4-ERK/JNK/p38MAPK轴部分抑制HPH大鼠的肺血管重构。因此,JNK相关抑制剂有望成为抑制PASMCS增殖的药物之一。

p38 MAPK通路一方面可导致自噬激活,这是由于其可诱发内皮屏障功能障碍并可能破坏紧密连接。该通路激活同时使调节血管通透性的重要屏障蛋白下调,最终导致肺血管病变和重塑。黄芩苷可通过下调p38 MAPK/基质金属蛋白酶9通路来减轻慢性缺氧引起的PH[29]。另一方面,p38 MAPK通路可抑制自噬发生,如骨桥蛋白通过此信号通路抑制PASMCS自噬,促进HPH形成[30]。本实验也证实人抵抗素样分子β可通过Ca2+内流激活MAPK通路,抑制自噬进而诱导PASMCS增殖,提示钙离子通道与自噬通路相关性[31]。与激活mTOR通路抑制自噬不同的是,p38 MAPK通路在肺血管细胞自噬过程中呈双面性,其通过不同下游靶点抑制/激活自噬,皆可在PASMCS细胞增殖调控中起促进作用,这或许使p38 MAPK抑制剂成为治疗HPH的前景靶向药物成为可能。

ERK1/2通路活化能够直接促进LC3表达上调,自噬通量增加。ERK1/2抑制剂可减弱钙蛋白酶-2的磷酸化从而减轻PASMCS增殖。醛脱氢酶2对PASMCS和HPH迁移和增殖具有保护作用,或是通过阻断ERK1/2-Beclin1通路以抑制自噬来实现[32]。miRNA-205-5p可通过传导细胞骨架调控蛋白(microtubule associated monoxygenase,calponin and LIM domain containing 2,MICAL2)促进PASMCs增殖,ERK1/2抑制剂阻断MICAL2介导的对PASMCS增殖的促进作用。因此抑制ERK1/2可作为HPH治疗的理想治疗靶点。

ERK5属于MAPK信号家族,可调节细胞增殖和分化、细胞存活等信号转导。过表达ERK5可导致p62蛋白表达水平增加,LC3Ⅱ、Beclin1表达水平降低,细胞自噬受到抑制[33]。既往研究发现,ERK5抑制剂可缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用。ERK5蛋白激酶协调激活信号,导致炎性细胞因子如白介素1β、基质细胞衍生因子1、单核细胞趋化蛋白-1的增加,抑制自噬从而触发右心室肥大过程。

上述研究证实自噬在HPH中的两面性,这些相互矛盾的结果也可能是由于实验条件的差异,如治疗时间和氧气水平、LC3B自噬通量增加的具体含义。在所有PH模型中,与真实人类PH发展相关的组织病理学改变、肺压力和右心功能之间也可能存在不同。这些复杂因素也可能影响自噬在HPH中的具体作用,针对自噬与HPH之间的作用仍有待于进一步深入研究。目前为止,自噬调节疗法的应用大多局限于实验阶段,只有少数能调节自噬的化合物被用于临床,自噬激活剂如mTOR抑制剂雷帕霉素和自噬抑制剂如氯喹等,未来需要更多的研究提供新的实验与理论依据。

三、展 望

近年来,临床工作中发现慢性阻塞性肺疾病患者继发HPH者逐年上升,特别是多见于老年患者。如何快速有效地诊断和干预HPH这一相关疾病,给临床工作提出了新的要求和挑战。越来越多的研究表明,HPH与自噬密不可分,但是具体关系及相关机制尚未完全明确,期待今后开展更多的相关研究进一步明确两者关系及发病机制,为更好地诊断和治疗HPH提供新的方向和思路。