围生期缺血缺氧性脑病的微RNA生物标志物筛选研究

曾浩，陈玉霞，司文

围生期缺氧缺血性脑病（HIE）主要是指因多种原因共同作用导致的缺氧窒息，继而引起部分或完全缺氧或（和）脑血流减少导致的脑缺氧缺血性损害［1］。病儿主要表现特征涵盖意识障碍、原始反射异常以及肌张力改变等，可能伴有多脏器的不同程度损伤，预后不良［2］。因此，如何有效早期诊断HIE具有极其重要的意义。既往，临床上主要是通过核磁共振以及脑电图等手段实现对HIE的诊断，但均存在耗时较长的缺陷，可能导致病儿的最佳治疗时期错过［3］。因此，利用病儿脐血进行快速、准确、无创的生物标志物检测无疑是最佳的解决方案。目前，高通量测序以及检测技术得到显著的发展，若能通过上述技术筛查出脐带血血液中和缺氧状态相关的生物标志物，并结合高通量自动快速检测设备检测分子标志物可有效提高HIE诊断的准确性［4］，继而为医疗手段或神经保护药物的使用时机和药物剂量提供依据。本研究通过HIE的微RNA（miRNA）生物标志物的筛选，为临床治疗提供支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料 通过动态队列研究法获取深圳市龙华区中心医院2020年1月至2021年1月144例HIE病儿作为受试者。将其根据病情严重程度的差异分作轻度HIE组42例、中度HIE组62例以及重度HIE组40例，另取同期该院50例健康新生儿作为对照组。各组基线资料差异无统计学意义（P＞0.05），可比性较高，见表1。入组标准：（1）HIE病儿均符合中华医学会儿科学会新生儿组修订的新生儿HIE诊断标准［5］；（2）均为足月单胎妊娠；（3）娩出后24 h内入院接受诊治。排除标准：（1）合并败血症或（和）脑膜炎等并发症；（2）伴有先天性畸形或遗传性疾病；（3）正参与其他研究。本研究获深圳市龙华区中心医院伦理委员会批准（批号2019-072-02），病儿监护人或近亲属对研究方案签署知情同意书。

表1 各组新生儿基线资料对比

1.2 研究方法 （1）脐带血采集及处理：在受试者娩出之后，分别采集200 μL的脐带血保存在无RNA酶EP管内，滴加1 mL的Trizol LS［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］充分混匀，保存至-80 ℃冰箱中备用。（2）总RNA提取：首先将标本进行冰上溶解处理，滴加200 μL的氯仿混匀，进行时长为10 min的静置处理，之后开展时长为15 min的12 000 r/min离心处理。采集上层水相400 μL并放置在无RNA酶的EP管内，继续滴加400 μL异丙醇混匀。冰上静置10 min后以14 000 r/min为离心条件离心15 min。之后去除上清液，取沉淀物加入乙醇清洗后12 000 r/min离心5 min。吸去乙醇，晾干后，加入10 μL去酶水，液氮速冻RNA溶液，样品用干冰运输交给公司进行二代测序。（3）二代转录组测序及差异表达基因分析：通过第二代测序技术实现，并筛选reads数＞2的差异基因，阈值为FDR（false discovery rate）＜0.05，log2FC ［fold change （condition 2/condition 1）for a gene］＞2或log2FC＜-2，根据以上条件得出差异表达的miRNA。（4）候选miRNA关联性分析：筛选出与HIE分度正相关或负相关的候选miRNA，通过两变量关联性分析方法进行分析每个miRNA与HIE分度的相关性，将HIE临床分度为有序分类变量并设为x，临床分度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应为值1、2、3，将miRNA的reads数作为连续定量变量，设为y。因双变量中含有一有序分类变量，因此SPSS应采用Spearman关联性分析方法进行分析其相关性。根据其秩相关系数rs筛选出3～5个-1≤rs≤-0.5或1≥rs≥0.5，且P≤0.05的miRNA，作为预测HIE的miRNA生物标志物。（5）分组方式：将所有HIE病儿按照是否合并脏器损伤分为合并脏器损伤组102例以及未合并脏器损伤组42例。（6）血清诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮素-1水平检测：检测方式均为酶联免疫吸附测定，操作以试剂盒（购自上海西唐生物科技有限公司）说明书为准。

1.3 统计学方法 数据处理软件选择SPSS 22.0。以表示计量数据，开展正态性检验及方差齐性检验，符合正态分布，两组比较行两独立样本t检验。多组间对比行单因素方差分析。计数资料以例（%）表示，开展χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 芯片检测结果分析 miRNA芯片通过扫描、分析以及标准化处理，结果发现miRNA芯片共检测miRNA达921种。相较于对照组，HIE病儿血浆中有29种miRNA表达异常升高，26种miRNA表达异常下降，选择差异有统计学意义的miRNA实施生物学信息分析，发现了miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p可能具有潜在的预测HIE作用。

2.2 各组新生儿miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表达对比 重度HIE组miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表达水平均高于对照组和轻度HIE组以及中度组，且轻度HIE组、中度HIE组miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表达水平均高于对照组，中度HIE组miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表达水平均高于轻度HIE组（均P＜0.05），见表2。

表2 各组新生儿miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表达对比/

表2 各组新生儿miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表达对比/

注：HIE为缺氧缺血性脑病。①与对照组相比，P＜0.05。②与轻度HIE组相比，P＜0.05。③与中度HIE组相比，P＜0.05。

miR-6794-5p 0.47±0.11 0.89±0.15①1.46±0.20①②2.24±0.24①②③16.40＜0.001组别对照组轻度HIE组中度HIE组重度HIE组F值P值例数50 42 62 40 miR-4472 0.20±0.04 0.37±0.08①0.55±0.09①②0.71±0.12①②③10.53＜0.001 miR-5195-3p 0.78±0.15 0.92±0.18①1.45±0.23①②2.34±0.28①②③14.29＜0.001

2.3 HIE病儿病情严重程度和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达的关系分析 HIE病儿病情严重程度和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达均呈正相关关系（均P＜0.05），见表3。

表3 HIE病儿病情严重程度和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达的Spearman相关性分析

2.4 HIE病儿合并脏器损伤和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达的关系分析 合并脏器损伤HIE病儿miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达水平均高于未合并脏器损伤组（均P＜0.05），见表4。

表4 HIE病儿合并脏器损伤和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达的关系分析/

表4 HIE病儿合并脏器损伤和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达的关系分析/

注：HIE为缺氧缺血性脑病。

组别合并脏器损伤组未合并脏器损伤组t值P值miR-6794-5p 1.70±0.31 1.37±0.23 6.22＜0.001例数102 42 miR-4472 0.60±0.09 0.46±0.03 9.84＜0.001 miR-5195-3p 2.05±0.18 1.58±0.12 15.54＜0.001

2.5 两组血清iNOS及内皮素-1水平对比 HIE组血清iNOS及内皮素-1水平均高于对照组（均P＜0.05），见表5。

表5 两组血清iNOS及内皮素-1水平对比/

表5 两组血清iNOS及内皮素-1水平对比/

注：HIE为缺氧缺血性脑病，iNOS为一氧化氮合酶。

组别对照组HIE组t值P值内皮素-1/（ng/L）34.58±9.28 241.93±32.15 44.89＜0.001例数50 144 iNOS/（U/mL）21.05±3.16 47.11±6.23 28.31＜0.001

3 讨论

临床表现、影像学检查和脑电图检查是目前临床上广泛用以诊断HIE的手段，但其无法判断脑缺氧缺血后的损伤实质，且灵敏度以及特异度均较低，对后续治疗用药影响较大，存在一定的局限性［6-8］。随着高通量测序技术的日益发展，大规模人群样本的疾病相关生物标志物筛选得以实现［9-10］。生物标志物可反映生理状态或疾病过程中细胞变化情况，包括miRNA、细胞代谢物以及蛋白质等小分子，可用于预测患病概率、辅助诊断以及预后评估中。其中miRNA主要是指一类约由20个核苷酸组成的非编码RNA，其可通过和靶mRNA的互补序列特异性结合，继而调控相关靶基因的表达，进一步参与多种疾病的发生、发展过程［11-12］。有研究报道显示，miRNA与人类癌症、中枢神经系统疾病以及心血管疾病均有密切相关，可能是多种疾病诊断、治疗以及预后的潜在生物标志物［13-14］。

本研究结果发现，相较于对照组，HIE病儿血浆中有29种miRNA表达异常升高，26种miRNA表达异常下降。这在既往相关研究报道中得以佐证，说明了存在一部分miRNA和HIE的发生、发展有关。然而，另有研究报道发现miRNA-210在HIE中存在异常表达［15］，而在本研究中并未检测到该miRNA的异常改变。导致上述差异发生的原因可能和医疗技术的飞速发展以及医疗条件的日益完善有关；此外，实验过程中难免存在一定的偏倚，从而导致结果出现偏颇。此外，miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p可能具有潜在的预测HIE作用，且上述3种miRNA在HIE病儿中均存在异常高表达，并随着HIE病儿病情的加重，其表达升高。提示了miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p可能是HIE的miRNA生物标志物。究其原因，上述3种miRNA可通过调控下游靶基因的表达，进一步参与HIE的发生、发展过程。然而，关于其具体作用机制有待进一步研究明确，亦为我们今后的研究提供了新的方向以及思路。另外，合并脏器损伤HIE病儿合并脏器损伤和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达水平均高于未合并脏器损伤组。分析原因，可能是上述3种miRNA参与了HIE各脏器损伤的病理过程［16-17］。这反映了上述3种miRNA表达水平的检测可能有助于临床预测HIE病儿的合并脏器损伤情况，可为已出现多脏器功能不全趋势但尚未出现显著表现病人提供早期预警指导，继而为临床诊治提供指导依据，达到改善预后的目的。然而，miRNA在心肌缺氧缺血损伤以及其他多种情况下降均可能出现异常表达［18-19］，因此，需开展进一步试验明确各脏器组织特异相关的miRNA表达。此外，本研究所检测的样本为脐带血，其中miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表达可能受多种因素的干扰，今后的研究可以考虑采集多种不同类型标本进行试验，提高数据的可信度。HIE组血清iNOS及内皮素-1水平均高于对照组。考虑原因，可能是iNOS和内皮素-1在HIE的发生、发展过程中具有调节平衡作用。

综上所述，miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p可能是HIE的潜在miRNA生物标志物，上述miRNA表达水平和病儿病情严重程度以及脏器损伤有关，可能有助于辅助诊断HIE以及预测脏器损伤发生情况，值得临床重点关注。然而，本研究尚且存在一定的有待完善之处，在今后的相关研究中，应增加样本量，以获取更为准确、可靠的数据。