基于数字减影血管造影的VX2肝癌兔靶向药物治疗模型的建立

含笑，胡茂能，王国亮，祁磊，赵毛毛

国内外的多项临床随机对照研究证实经导管动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoemboli-zation，TACE）在原发性肝癌治疗中的显著有效性，TACE已成为无法切除的原发性肝细胞肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）的首选治疗方式［1-2］。HCC是一种典型的富血供肿瘤，不论是肿瘤的早期还是晚期，血管的生成都是肿瘤进展或转移的重要原因［3-4］。现有研究同样认为TACE术后病人复发的原因和HCC新生血管有关［5］。贝伐单抗（Bevacizumab， Bev）是当前公认具有显著疗效的抗血管生成药物［6-7］。目前文献报道贝伐珠单抗主要与阿替利珠单抗、索拉非尼等联合应用可显著改善HCC病人生存［8］。VX2肝癌是Shop病毒在兔皮肤上诱发的一种鳞癌，经过传代后可作为兔移植性肿瘤，并且在肝脏的移植成功率较高［9-10］。但目前关于VX2兔肝癌在数字减影血管造影（DSA）设备引导下实施介入治疗，尤其是以Bev为代表的靶向药物介入治疗研究尚不多见。因此，采用VX2兔建立一种稳定的肝癌靶向药物治疗模型具有重要的实践意义。2019年11月至2022年6月，本研究通过总结建立基于DSA的VX2兔肝癌靶向药物治疗模型的相关经验，同时分析影响实验兔死亡的危险因素，为VX2肝癌实验兔进行介入诊疗提供经验借鉴。

1 资料与方法

1.1 一般资料 荷瘤兔1只和新西兰大白兔（实验兔）44只由南京云桥璞瑞生物科技有限公司，实验动物合格证号：202254638，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2021-0016。荷瘤兔，雄性，体质量2.05 kg。实验兔，雌、雄各22只，体质量（2.35±0.40）kg，范围为1.80～2.85 kg。使用随机数字表法将实验兔随机等分为两组，各22只，分别行常规TACE治疗和Bev联合TACE治疗。本研究获合肥市第三人民医院伦理委员会批准（批号2019LLW020）。

1.2 肿瘤移植与传代 使用10%水合氯醛以3 mL/kg剂量腹腔内注射进行麻醉。以外科手术剥离荷瘤兔背部瘤体，切取鱼肉状瘤组织，置于20 000 U庆大霉素注射液+50 mL生理盐水的混悬液中，然后使用眼科剪将瘤块剪成直径1～2 mm的碎块以备肿瘤移植和传代使用。将实验兔使用上述同样方法麻醉后进行开腹直接穿刺接种法肿瘤移植：常规备皮、消毒后，于实验兔剑突下正中偏左作一纵向切口，长度约2 cm，逐层打开腹腔直至暴露肝脏左内叶，以4F规格的空心穿刺针直视下斜行轻柔刺破肝包膜，插入深度约为肝包膜下5 mm，用其内芯推入3～5个瘤块，随后以相应规格的明胶海绵颗粒4～5粒沿穿刺针推送，封堵穿刺通道后拔出穿刺针，分层缝合腹部切口。最后，用注射器抽取1 mL（含上述组织块8～10块）经21 G穿刺针注入健康新西兰兔双侧后肢皮下以保种传代。术后连续3 d予以实验兔后肢肌肉注射青霉素钠注射液800 000 U/d进行常规抗感染。

1.3 肿瘤的介入治疗

1.3.1 设备与造影方法 机器型号为美国GE品牌3100IQ数字减影血管造影机，所有实验兔在介入治疗前均行经微导管股动脉-肝动脉造影，所有手术均由同一名实验员完成。实验兔右侧腹股沟区备皮、常规消毒铺巾，轻触股动脉搏动区，于该区作一纵行切口，钝性分离至完全暴露股动脉，于股动脉下穿4号缝合线置于近心端，随后提紧缝线用以暂时阻断血流，使用眼科剪将股动脉远心端剪一小斜行切口，将3F微导管经小切口直接插入股动脉，透视下将微导管置于腹腔干开口处进行造影，采用路图技术超选择插管进入肝总动脉，连接高压注射器行DSA检查［11］。造影剂（碘佛醇，规格为320 mgI/mL，江苏恒瑞医药股份有限公司）流速为2～3 mL/s，总量为6 mL。术毕拔管，结扎右侧股动脉，逐层缝合切口，包扎伤口。

1.3.2 介入治疗 常规TACE组：将罂粟乙碘油（江苏恒瑞医药股份有限公司）0.3 mL/kg+阿霉素（瀚晖制药有限公司）2 mg/kg充分乳化制成混悬液，经3F微导管将混悬液缓慢注入靶血管内。Bev联合TACE组：超选择插管至肿瘤血管供血动脉后，首先经微导管缓慢注入Bev（安维汀，罗氏制药有限公司）10 mg/kg，然后行TACE治疗（方案同常规TACE组）。

1.4 观察指标 手术后第14天对实验兔进行CT平扫+增强检查评估肿瘤情况，同时抽取静脉血了解实验兔肝肾功能，对于术后14 d内死亡的实验兔认为建模失败。观察可能影响手术效果的相关指标，包括性别、体质量、术中出血量、手术前后静脉血血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）及总胆红素水平、尿素氮、血肌酐水平。

1.5 统计学方法 使用SPSS 26.0软件进行分析。正态分布计量数据用表示；计数数据使用率或构成比进行描述。连续性变量的差异采用两独立样本t检验，分类资料的单因素分析采用χ2检验。多因素分析采用非条件二分类logistic回归分析。受试者操作特征曲线（ROC曲线）分析相关因素的诊断价值，使用Delong法比较曲线下面积（AUC）之间的差异。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料 A、B两组实验兔介入治疗前静脉血肝肾功能、体质量、性别等基线资料差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 两组实验兔肝癌介入治疗前基线资料比较

2.2 影响术后死亡的单因素分析 两组实验兔均移植成功，未出现广泛性腹腔转移及腹腔积液，造影显示40只（占比90.91%）肿瘤呈典型富血供病灶。介入手术后第7天，所有实验兔均采集静脉血检查肝肾功能。根据实验兔手术后生存时间分为死亡组（存活时间＜14 d）和存活组（存活时间≥14 d），其中死亡组为10只，存活组为34只。分别比较相关因素在组间的差异。见表2。

表2 影响实验兔肝癌介入治疗术后死亡的单因素分析

2.3 影响术后死亡的多因素分析 将上述单因素分析差异有统计学意义的变量（体质量、GPT、GOT、总胆红素）作为自变量，再以是否出现实验兔术后短期内死亡（出现为1，未出现为0）作为因变量，进行非条件二分类logistic回归分析，采用逐步向后法拟合优化模型进行分析，结果显示：体质量低、术后总胆红素高是实验兔介入术后短期内死亡的独立影响因素（均P＜0.05），见表3。

表3 影响实验兔肝癌术后死亡的多因素logistic回归分析

2.4 影响因素对死亡事件的预测效能 采用ROC曲线进行诊断效能分析，显示术前体质量、总胆红素以及两者联合预测的AUC分别为0.90（0.81，0.99）、0.89（0.80，0.99）和0.96（0.90，1.00），灵敏度分别为90.0%、91.0%和90.0%，特异度则分别为76.5%、73.5%和91.2%。此时体质量和总胆红素的最佳临界值分别为2.44 kg和4.84 μmol/L。进一步比较AUC之间的差异，显示AUC体质量比AUC总胆红素（Z=0.15，P=0.877）；AUC联合比AUC体质量（Z=1.83，P=0.067）；AUC联合比AUC总胆红素（Z=0.07，P=1.833）。

3 讨论

HCC的肿瘤组织具有丰富的血供以及较多的新生血管，前者对TACE的良好疗效提供了理论基础，而后者则对肿瘤的快速生长和转移起到了重要作用［12-13］。2017年，欧洲一项研究认为，对于原发性肝癌病人而言，传统的TACE仍然是二期肝切除以及降期治疗后肝移植的一线治疗策略及可能的标准治疗方法，并且可以显著提高病人生存质量［14］。国内一项大样本回顾性分析研究显示经TACE治疗的原发性HCC病人的1、2、3年累积生存率分别为73.90%、40.20%和22.20%［15］。而梁彦玲等［16］研究报道TACE治疗原发性肝癌的并发症情况，显示TACE治疗的安全可行性。目前，鉴于肝癌发生时常出现的富血供、多发病灶甚至病灶较大等情况，TACE在HCC介入治疗中仍然有着重要的地位［17-18］。

本研究中44只实验兔均成功实施了开腹移植肿瘤，并在DSA设备引导下完成了不同的介入治疗，显示了基于DSA对VX2兔肝癌靶向药物治疗的模型建立较为稳定和可靠。同时本研究还发现，在完成介入手术治疗后14 d内还发现实验兔具有一定死亡率，进一步行非条件二分类logistic回归分析显示术前较低的体质量和介入治疗后较高的总胆红素是实验兔介入治疗后死亡的独立危险因素。ROC曲线分线显示两个危险因素均具有较高的诊断效能，在截断值分别为2.44 kg和4.84 μmol/L时，均有着较高的灵敏度和特异度。将术前体质量和术后总胆红素进行联合预测时，比较显示3种诊断曲线的AUC之间差异无统计学意义，可能和样本量相对较小有关，虽然联合诊断灵敏度无明显变化，但特异度较单独预测时均明显提高，显示联合预测可能有着更好的诊断效能。

目前，DSA已成为介入治疗尤其是肝癌介入治疗最重要的引导设备之一［19-21］。虽然DSA引导下的VX2兔肝癌靶向治疗建模成功率较为稳定，但本研究显示实验兔体质量≤2.44 kg时，对实验兔术后死亡的预测效能最高。既往一项关于肝动脉、门静脉双介入的VX2兔肝癌模型研究中发现，实验兔体质量＜2.5 kg时容易在建模后死亡［11］，本研究与其基本一致。究其原因，可能是较小体质量的实验兔血容量较少、耐受性较差。此外，体质量较小的实验兔其血管较细，很多时候需要反复穿刺，增加了创伤性。

本研究还显示，实验兔术后肝功能状态同样能影响建模的成功率。单因素分析显示GPT、GOT以及总胆红素在存活组和死亡组之间均差异有统计学意义，显示无论行TACE还是TACE联合Bev治疗，术后实验兔肝功能均有一定程度受损。而多因素分析则显示总胆红素为实验兔死亡的独立危险因素，也进一步提示实验时应适当减少栓塞剂的用量，尝试保护肝功能药物的应用，以减轻肝功能受损程度。

本研究尚有一定的局限性，一方面，样本量相对较少，有一定的选择性偏倚；另一方面，实验人员的熟练程度也在一定程度上影响着建模的成功率。

综上所述，在DSA设备引导下行VX2兔肝癌介入治疗模型建立具有较高的可靠性，可以为肝癌的微创治疗提供更好的实验基础，值得推广应用。