基于超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱技术的十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分定量检测研究

陈刚，汪生，宫鹏

中风是一种常见的老年性疾病，具有高发病率、高致死率、高致残率等特点［1-2］。复方中药制剂在中医整体观和辨证论的指导下，多成分协同、多向调节，具有不良反应小、治疗费用低、安全性能好等优点，在疾病治疗领域发挥越来越重要的作用［3-5］。十二味参芍益脑合剂由当归、生地黄、炒白芍、川芎、黄芩、栀子、玄参、菊花、牡丹皮、车前子、龙骨和甘草12味中药材组成，是太和县中医院多年应用经验方。该药适合于肝阳上亢型的中风及各类型的偏头痛，临床疗效确切。

前期十二味参芍益脑合剂主要化学成分分析研究工作中，共鉴定出绿原酸、栀子苷、黄芩苷、甘草苷、芍药苷和芍药内酯苷等27个化学成分。在现有的质量标准中，含量测定仅考察黄芩苷含量，而制剂中其他主要化学成分的含量及相关质量控制指标不够全面。近代药理学研究表明：黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善血脑屏障通透性和神经保护作用［6-9］；芍药苷和芍药内酯苷，具有抗炎、镇痛和抗氧化的作用［10-12］；栀子苷也可通过抗炎、抑制细胞凋亡等过程协同治疗脑缺血等疾病［13-15］。2021年3月至2022年5月，本研究依据前期十二味参芍益脑合剂成分解析及主要化学成分的药理作用确定12种主要化学成分检测指标，建立超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱（ultra-performance liquid chromatography tandem hybrid orbitrap mass spectrometry， UPLC-Q-Orbitrap-MS）测定法，为后期的十二味参芍益脑合剂质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 Thermo Q-Exactive plus四极杆-静电场轨道阱质谱仪（配有在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和Xcalibur工作站，美国Thermo Fisher公司）；Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；Waters UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm，美国Waters公司）；XPE205型电子分析天平（德国Sartorius）；5424R台式高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）；Milli-Q Integral 5超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.1.2 试药与试剂 十二味参芍益脑合剂（批号21063001、21071301、21081001、21083101、21092301、21101401、21110801、21110901、21111001、21121301、22012101、22022301、22030901、22042301、22042401、22042501）共16批，由太和县中医院提供。对照品：芹菜素（批号C10690542）、黄芩素（批号C12773748）、甘草素（批号C10828731）、千层纸素A（批号C12223962）、绿原酸（批号C11860894）、栀子苷（批号C12714185）、黄芩苷（批号C12378847）、甘草苷（批号C13546456）、芍药苷（批号C11860848）和柚皮苷（批号C10609484）均购自上海麦克林生物技术有限公司；芍药内酯苷（批号G26N11L132310）、汉黄芩苷（批号A09GB144759）和汉黄芩素（批号J15GB154492）均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇（LC-MS级别，美国Thermo Fisher公司）。

1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取12种对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度（芹菜素、黄芩苷和汉黄芩苷加入2 mL二甲基亚砜助溶），制成500 mg/L对照品储备液。取对照品储备液适量，用甲醇稀释为混合对照品工作液5（其中栀子苷和黄芩苷均为50 mg/L；绿原酸、芍药苷和汉黄芩苷均为5 mg/L；芍药内酯苷和黄芩素均为2 mg/L；芹菜素、甘草素、甘草苷、汉黄芩素和千层纸素A均为0.5 mg/L），再将该混合对照品工作液5分别稀释4/3倍（工作液4）、2倍（工作液3）、4倍（工作液2）、10倍（工作液1），得到5种浓度的混合对照品工作液。配制柚皮苷对照品溶液5 mg/L作为内标工作液。

1.3 供试品溶液的制备 取十二味参芍益脑合剂原液适量，经50%甲醇溶液稀释500倍，精密吸取450 μL，加入内标工作液（5 mg/L）50 μL，混匀，4 ℃条件下14 000 r/min离心20 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.4 液相色谱条件 采用Waters UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm），以乙腈为流动相A、以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液为流动相B，线性梯度洗脱：0 min 10% A→2 min 10% A→4 min 20% A →8 min 24% A→10 min 35% A→16 min 65% A→18 min 65% A→18.01 min 10% A→20 min 10% A，流速：0.25 mL/min，柱温：35 ℃，进样盘温度：4 ℃，进样量：5 μL。

1.5 质谱条件 可加热的电喷雾离子源（HESI），负离子检测模式，喷雾电压：-3.5 kV，毛细管温度：350 ℃，辅助气加热温度：300 ℃，雾化氮气压力：350 kPa，辅助气压力：70 kPa，离子扫尾气压力：3.5 kPa，扫描方式：平行反应监测（parallel reaction monitoring，PRM）扫描模式。12种分析物和内标的化合物信息、保留时间和质谱关键参数等具体情况如表1所示。

表1 十二味参芍益脑合剂中12种分析物和内标的平行反应监测（PRM）参数

1.6 统计学方法 物质浓度和峰面积比值之间的线性回归采用加权最小二乘法计算。应用SPSS 23.0软件对本研究数据进行统计学分析，组间比较采用独立样本t检验，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 专属性实验 在所建立的测定条件下，绿原酸、栀子苷、芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷、柚皮苷、黄芩苷、芹菜素、甘草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A、汉黄芩苷和汉黄芩素的保留时间分别为4.71、6.03、6.52、6.90、7.89、9.31、11.67、11.77、12.06、12.99、14.08、15.60、15.95 min，各待测物和内标完全分离，峰形良好，典型色谱图见图1，方法的专属性良好。

图1 十二味参芍益脑合剂中12种混合对照品溶液、供试品溶液的平行反应监测（PRM）色谱图：A1为绿原酸对照品；A2为绿原酸供试品；B1为栀子苷对照品；B2为栀子苷供试品；C1为芍药苷和芍药内酯苷对照品；C2为芍药苷和芍药内酯苷供试品；D1为甘草苷对照品；D2为甘草苷供试品；E1为黄芩苷对照品；E2为黄芩苷供试品；F1为芹菜素和黄芩素对照品；F2为芹菜素和黄芩素供试品；G1为甘草素对照品；G2为甘草素供试品；H1为汉黄芩苷对照品；H2为汉黄芩苷供试品；I1为汉黄芩素和千层纸素A对照品；I2为汉黄芩素和千层纸素A供试品；J1为柚皮苷对照品；J2为供试品添加柚皮苷

2.2 标准曲线 精密量取“1.2”项下对照品线性工作液适量，50%甲醇稀释10倍后，制成栀子苷和黄芩苷的质量浓度均分别约为0.50、1.25、2.50、3.75和5.00 mg/L，芍药苷、汉黄芩苷和绿原酸的质量浓度均分别约为50、125、250、375和500 μg/L，芍药内酯苷和黄芩素的质量浓度均分别约为20、50、100、150和200 μg/L，芹菜素、甘草苷、甘草素、汉黄芩素和千层纸素A的质量浓度均分别约为5、12.5、25、37.5和50 μg/L，内标柚皮苷均为500 μg/L的5种浓度的标准曲线测试溶液，分别测定。以待测物峰面积（Ax）和内标峰面积（Ai）比值R（Ax/Ai）对浓度（C）进行线性回归（不加权）。12种主要化学成分在设定的线性浓度范围内，峰面积比值和进样浓度呈现良好的线性关系，标准曲线的相关系数（r）均大于0.99。

2.3 基质效应和加样回收率试验 取21063001、21083101、21101401、21121301、22022301和22042401共计6个批次十二味参芍益脑合剂适量，等体积混匀后，经50%甲醇稀释500倍。取稀释500倍的混合样本450 μL，分别加入混合对照品线性工作液（2，3，4）和内标工作液各50 μL，制得样本添加低（low，L）、中（medium，M）、高（high，H）浓度的加样回收率试验溶液，每个浓度样品平行制备3份；取“1.2”项对照品工作液2、3、4，经50%甲醇稀释10倍，作为对照品溶液；照“1.3”项制备混合样本供试品溶液，测定其12种主要化学成分本底值。参照内标法以峰面积比计算12种主要化学成分的测得质量浓度，并分别计算回收率和基质效应，结果见表2。12种主要化学成分在L、M和H浓度的回收率范围为80.58%～112.90%［相对标准差（RSD）均低于10%］，表明本法准确度良好；基质效应范围为76.58%～110.80%（RSD均低于10%），说明本法无明显的基质增强或抑制效应，方法可准确定量。

表2 十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分含量测定加样回收率试验结果

2.4 精密度试验 取“2.3”项下方法制备“中浓度”的加样供试液，连续进样6次，计算12种主要化学成分峰面积和内标峰面积比值的RSD（n=6）范围为0.72%～4.34%，表明仪器进样精密度良好。

2.5 重复性试验 按照“2.3”项下方法制备“中浓度”的加样供试液6份，分别测定，12种主要化学成分峰面积和内标峰面积比值的RSD（n=6）范围为0.69%～4.71%，方法符合重复性要求。

2.6 进样盘（4 ℃）稳定性 按照“2.3”项下方法制备L、H浓度的加样供试液，分别在0和12 h进样测定，记录色谱图。计算12种主要化学成分浓度，样本放置12 h，各物质的准确度范围为89.7%～107.0%（RSD均低于10%），表明该处理条件下的12 h内稳定性良好。

2.7 样本测定结果 按照“1.3”项下方法分别配制供试品溶液，每批次取3瓶，每瓶平行配制3份，分别测定，记录色谱图。共检测了16批十二味参芍益脑合剂，生产日期分别为2021年7月（21063001、21071301）、2021年8月（21081001）、2021年9月（21083101、21092301）、2021年10月（21101401）、2021年11月（21110801、21110901、21111001）、2021年12月（21121301）、2022年1月（22012101）、2022年2月（22022301）、2022年3月（22030901）、2022年4月（22042301、22042401、22042501），12种主要化学成分的测定结果见表3，黄芩苷含量均＞1 g/L，为含量最高的主要化学成分（约占总物质含量的50%），符合制剂标准的规定。

2.8 不同批次间含量差异分析 根据测定的16批次中12种主要化学成分浓度，结合多元变量统计分析，建立模型，考察各批次之间的物质差异。采用Metaboanalyst软件进行数据的归一化、对数转化和中心化，建立主成分分析（principal component analysis，PCA）模型，结果见图2A，同一批次样本聚在一起，表明同一批次样本之间差异小；在分析批次之间差异时，除批次1、2和4外，余下各批次几乎聚集在一起，表明制剂工艺整体相对稳定。将批次1、2和4定义为一组（第1组），余下各批次为另一组（第2组），建立偏最小二乘法判别分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA）模型，见图2B，得到变量投影重要性值（variable importance in theprojection，VIP值）。结合t检验计算得到P值，筛选出评价质量差异的标志物［16-17］，差异有统计学意义的物质见表4。结合P值和变异倍数（fold change，FC）值分析发现栀子苷和芍药内酯苷是导致批次1、2、4样本差异大的主要成分。其中栀子苷的VIP值最大（1.565）、P=0.005、FC=1.172，其含量仅次于黄芩苷（约占总物质含量的20%），栀子苷的含量测定，可作为进一步控制制剂质量的指标。

图2 十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分含量的多元变量统计分析图：A为16批次样本的主成分分析（PCA）得分图；B为PLS-DA分析得分图

表4 十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分差异物质分析

3 讨论

本研究定量的3对同分异构体（芹菜素-黄芩素、汉黄芩素-千层纸素A和芍药苷-芍药内酯苷），各自质谱检测参数相同，良好的色谱分离是保证3对同分异构体准确定量的必要前提；还需要兼顾单个样本的分析时间，以增加检测的通量。Waters HSS T3色谱柱是极性改良柱，可增大极性物质的色谱保留，研究采用Waters HSS T3色谱柱（100 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），优化色谱梯度，保证测定的3对同分异构体达到基本色谱分离的前提下，在20 min内即可完成十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分的同步定量。研究优化了各测定物的碰撞能，选择特征的二级碎片进行定量，保证定量的准确度和专属性［18-19］。

待测物在十二味参芍益脑合剂中浓度差别大，黄芩苷浓度最高，达1 g/L，甘草素和黄芩素浓度较低，在1～10 mg/L范围。因此合适的样本前处理方法，不仅可以避免高浓度测定物污染仪器和待测物响应饱和，还能将浓度低的物质准确检测。研究比较了样本经稀释50、100、500和1 000倍，发现稀释500倍最佳。研究还对稀释的溶剂组成进行优化，对比了20%甲醇、50%甲醇和70%甲醇3种体系。样本经20%甲醇稀释后，12 h内黄芩苷不稳定，50%甲醇和70%甲醇各待测物12 h内稳定性良好。结合流动相和溶液匹配的原则，最终选择稀释液为50%甲醇。定量方法采用内标法，可有效校正样本前处理和仪器的进样误差。取样前应将制剂充分摇匀，同时还要保证取样量，确保取样具有代表性。

综上所述，本研究建立了十二味参芍益脑合剂中绿原酸、栀子苷、芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷、黄芩苷、芹菜素、甘草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A的LC-MS测定法，测定16批次制剂中12种主要化学成分的含量，方法的分析效率高、专属性好、重复性好，同时发现栀子苷可以作为进一步评价制剂质量标准的成分，该研究为十二味参芍益脑合剂的质量控制提供科学的实验依据。