基于数据挖掘和实验验证探究大黄素治疗脓毒症相关急性肾损伤的作用机制

欧 贤,周金瑶,孙 饶,王亚萍,吴祯祥,赵凯奇,汪华学,2*

1蚌埠医学院第一附属医院重症医学科;2蚌埠医学院第一附属医院急危重症研究所;3蚌埠医学院,蚌埠 233000

脓毒症是宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]。肾脏是脓毒症最常见的受累器官之一,脓毒症相关急性肾损伤(sepsis-associated acute kidney injury,SA-AKI)常常成为脓毒症患者死亡的直接原因,具有极高的死亡率[2],给临床医生带来了前所未有的挑战。AKI迁延不愈,成为慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)的潜在风险增加,存活患者往往不可避免地进展到终末期肾病(end stage renal disease,ESRD),严重威胁患者的生活质量和生命安全[3]。

遗憾的是,目前预防和治疗SA-AKI的能力非常有限。积极的基于液体的治疗可能并无可靠的循证医学证据,甚至是有害的。使用血管活性药物维持血压,需要兼顾大循环和微循环,维持血压目标的多少才有助于避免AKI的发生尚无定论。如果肾脏预防失败则不得不采用肾替代(renal replacement therapy,RRT)治疗,但RRT干预的最佳时机和方式并不明确[4]。如果SA-AKI患者存活,虽然大多数患者肾功能会恢复,但对肾脏修复或肾功能修复失败的机制知之甚少,并且进展到CKD和ESRD的终身风险更高。迄今为止,尚无确切可靠的治疗AKI的药物,临床常规的治疗措施主要还是肾替代和对症综合治疗,肾脏功能的修复依赖于机体整体可靠的支持下的肾脏本身。因此,探索能够早期及时有效预防或治疗SA-AKI的药物或措施,避免慢性肾病的发生或促进肾脏修复,对于降低脓毒症患者病死率和提高存活患者的生活质量,具有重要的临床价值。

大黄素是一种自大黄、虎杖等中草药中提取的天然化合物,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用。既往研究证实大黄素对脓毒症患者具有保护作用;最近的研究显示,大黄素对氧化应激、炎症和细胞凋亡导致的损伤具有保护作用[5]。然而,尚不清楚大黄素能否改善SA-AKI患者的预后。本研究将通过生命科学相关数据库探寻SA-AKI发病过程的关键基因,并分析关键基因所涉及的炎症信号通路;继之通过动物实验探讨大黄素是否影响SA-AKI的炎症通路和对SA-AKI大鼠的保护作用及其机制,为其防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 数据库分析

1.1.1 SA-AKI发病过程关键靶点筛选

利用GEO数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索SA-AKI相关数据集,其中GSE186822符合条件,包含3个盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)模型和2个正常模型鼠肾的原始测序数据,将原始数据利用R语言DESeq2包处理,条件设定logFC>1,P<0.05,筛选出SA-AKI发病过程中的关键基因。最后利用GeneToList(www.genetolist.com)将差异基因的ID与名称进行比对,舍弃无法对应的基因ID。

1.1.2 潜在靶点的GO和KEGG 分析

基因本体论(gene ontology,GO)中生物过程数据库(biological process,BP)、细胞成分数据库(cellular component,CC)和分子功能数据库(molecular function,MF)分别描述了基因产物涉及的生物过程、所处的细胞环境和可能的分子功能。基因和基因组(kyoto encylopaedia of genes and genomes,KEGG)路径包括大多数已知的代谢途径和一些已知的调控途径。为了更进一步了解SA-AKI发病过程所涉及的生物学过程,进行了GO和KEGG富集分析。

1.1.3 PPI分析和核心网络构建

STRING网站(cn.string-db.org)是一个在线蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析数据库,它可以使用计算预测来补充现有的蛋白质与蛋白质相互作用的信息。将SA-AKI发病过程关键靶点生成PPI网络,以鼠为研究对象,最小相互作用得分为0.4。利用Cytoscape3.8.2软件将PPI结果导入,采用MCODE插件进行核心互作网络分析并展示,同时将KEGG富集分析的炎性信号通路涉及的核心靶点构建信号通路与核心靶蛋白的互作网络。

1.2 动物实验验证

1.2.1 药物、主要试剂和仪器

大黄素(货号为:E886074,纯度 ≥ 96%,上海麦克林生化科技股份有限公司);羧甲基纤维素钠和BSA封闭液(货号为:C8620、A8020,Solarbio公司);苏木素-伊红染液(货号为:KGA224,江苏凯基生物技术股份有限公司);Scr、BUN和MDA(货号为:C011-2-1、C013-2-1、A003-1-2,南京建成生物科技有限公司);IFN-γ、IL-17和TNF-α的ELISA检测试剂盒(货号为:YX-E21193、YX-E21019、YX-E21174,上海优选生物科技有限公司);一抗TNF-α、IL-17A、TRAF6、NF-κBp65、IκBα和p-IκBα(货号为:AF7014、DF6127、AF5376、AF5006、AF5002、AF2002,Affinity公司);内参GAPDH(货号为:AF2819,上海碧云天生物技术有限公司);HRP标记的山羊抗兔IgG和BCA蛋白定量试剂盒(货号为:GB23303、G2026,武汉赛维尔生物科技有限公司);ECL化学发光试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、上样缓冲液和蛋白Marker(货号为:SQ202、PG112、WJ103、LT101S,上海雅酶生物医药科技有限公司);电热扶风干燥箱(货号为:101AS-3,上海圣欣科学仪器有限公司);冰箱(货号为:BCD-258A/C,海尔);生物荧光显微镜(货号为:BX63,Olympus);天平(货号为:E200,赛多利斯);酶标仪(货号为:1681130,Bio-rad);TOUCH IMAGER接触式化学发光成像仪(货号为:E-BLOT XLi,E-Blot)。

1.2.2 动物模型、模型构建和分组方法

6～8周雄性SDF级Wistar大鼠(许可证号为:SCXK(鲁)20190003,济南朋悦实验动物繁殖有限公司),体重200～220 g。所有操作流程按照蚌埠医学院伦理委员会指定的实验室动物使用和护理指南进行,同时符合国际实验动物护理和使用指南建议(伦理审批号为:伦动科批字[2022]第403号)。将40只Wistar大鼠喂食普通饲料两周后,随机选取30只后按照随机数表法分为3组:假手术组(Sham)、脓毒症组(CLP)和药物组(CLP+EMO),每组各10只。造模前大鼠禁食12 h,自由饮水。CLP模型利用水合氯醛(40 mg/kg)麻醉大鼠,然后取腹部正中切口2 cm,暴露盲肠,用18号针头穿刺,少量盲肠内容物通过穿刺伤口挤出,关闭剖腹术切口,并给予无菌生理盐水(24 mL/kg)进行液体复苏。Sham组除未用18号针头穿刺盲肠,其余步骤与CLP组相同。CLP+EMO组在造模前5 d内灌胃(35 mg/(kg·d))含大黄素的羧甲基纤维素钠混悬液,另两组大鼠给予相同剂量的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液进行灌胃,最后一次灌胃后2 h时制备CLP模型[6]。干预期间,观察大鼠的一般情况,并记录各组死亡数目。造模后24 h时处死大鼠,留取肾组织及血液标本。

1.2.3 肾组织病理学检测

将大鼠肾组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中,经过梯度乙醇脱水后用石蜡包埋并切片,常规HE染色,在光镜下随机选取3个视野进行病理性观察并拍照。

1.2.4 肾功能和氧化指标测定

将经腹主动脉采集的血液经3 000 r/min离心10 min取上清液于-80 ℃保存备用。分别采用脲酶法和肌氨酸氧化酶法对各组血清肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)进行检测;硫代巴比妥酸法测定大鼠血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)。

1.2.5 血清IFN-γ、IL-17、TNF-α浓度测定

采用双抗体夹心ELISA测定-80 ℃保存的大鼠血清,严格按照试剂盒说明书进行实验操作测量干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素-17(interleukin 17,IL-17)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)含量。

1.2.6 Western blot

利用细胞裂解液和蛋白酶抑制剂混合液提取肾组织蛋白,BCA法测定其样品蛋白浓度。制备SDS-PAGE胶在120 V电压下电泳60 min,然后转移至PVDF膜后转膜120 min,BSA室温封闭2 h,TBST洗膜3次后加入稀释的一抗:TNF-α、IL-17A、TRAF6、NF-κBp65、p-IκBα、IκBα和GAPDH在冰箱中4 ℃过夜,TBST洗膜3次后加入二抗稀释液摇床孵育1 h,再次洗膜后加入显影液后进行曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 关键靶基因筛选

利用R语言的DESeq2设定logFC>1,P<0.05筛选出2 814个SA-AKI发病过程中与健康对照组之间存在显著差异的基因,经过GeneToList将ID与基因名称对应共2 801个匹配成功,故舍弃13个基因,将匹配成功的基因继续用于后续分析。图中展示了差异基因的火山图(见图1)。

图1 差异基因的火山图 Fig.1 Volcano diagram of differential genes

2.2 GO和KEGG分析

将2 801个关键基因进行了GO和KEGG分析,并将富集排名前十结果进行展示。GO中BP主要富集于脉管系统发育的调节、血管调节、内皮发育、伤口愈合、上皮细胞增殖、创伤反应、细胞-基质黏附和小GTP酶介导的信号转导等。CC则是富集于含胶原的细胞外基质、细胞顶端、膜筏、膜微区、基底外侧质膜、膜区、顶质膜、基底膜、细胞皮质和肌动蛋白细胞骨架等。MF富集于核苷、嘌呤核苷、核糖核苷、GTP、鸟苷酸、鸟苷酸核糖核苷酸、细胞粘附分子和整合素的结合以及GTP酶活性等(见图2)。KEGG则是富集于ECM-受体相互作用、IL-17信号通路、脂质和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、破骨细胞分化、PI3K-Akt信号通路、小细胞肺癌、TNF信号通路和弓形虫病(见图3)。

图2 GO功能富集分析 Fig.2 GO functional enrichment analysis

图3 KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis

2.3 PPI分析和核心网络构建

由于PPI互作网络最多允许2 000个蛋白之间进行构建,因此将2 801个基因通过差异倍数绝对值大小筛选出前2 000个基因进行分析。结果含有1 850个节点数和15 591条边。MOCDE筛选的核心互作网络含有69个节点和1 190条边,核心节点排名前十的基因为C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、C-C基序趋化因子配体2(CCL2)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、JUN原癌基因(JUN)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS)、Toll样受体2(TLR2)和整合素亚单位αM(ITGAM)(见图4)。同时将5条炎性信号通路与所涉及的36个核心靶点构建互作网络(见图5)。

图4 69个核心靶标的PPI互作网络Fig.4 PPI interaction network of 69 core targets

图5 炎性信号通路与核心靶标的互作网络Fig.5 Interaction network between inflammatory signaling pathways and core targets

2.4 各组大鼠一般情况观察和死亡率比较

Sham组灌药期间死亡2只,手术后24 h未出现死亡,大鼠皮毛顺滑,呼吸正常,行为良好。CLP组灌药期间未死亡,造模24 h后死亡2只,大鼠皮毛顺滑度较低,盲肠化脓性感染呈深黑色,反应较迟钝,全身乏力。CLP+EMO组灌药期间死亡1只,造模24 h后死亡2只,症状相对CLP组有所缓解,但出现腹泻症状。Sham组、CLP组和CLP+EMO组6 d死亡率分别为20.00%、20.00%和30.00%,3组死亡率比较无统计学意义(P> 0.05)(见表1)。

表1 大鼠一般情况和死亡率Table 1 General condition and mortality of rats

2.5 肾组织病理学结果

通过HE染色法观察到Sham组的肾小球结构清晰,大小无改变,肾小管无肿胀、水肿,未见空泡化改变,高倍镜下无炎细胞浸润;而CLP组则肾小球大小不一,有萎缩和分裂现象,肾小管扩张,空泡样改变多见,高倍镜下可见大量炎性细胞浸润;CLP+EMO组相比于CLP组肾小球大小不一,有萎缩和分裂现象,肾小管扩张,空泡样改变减少,高倍镜下见炎性细胞浸润减少(见图6)。

2.6 大鼠血清肾功能和氧化应激指标

与Sham组相比,CLP组大鼠血清Scr和血浆BUN水平显著升高(P<0.001),同时反映机体脂质过氧化的程度的MDA含量也显著升高(P<0.001),与CLP组比较,CLP+EMO组中的Scr、BUN和MDA水平降低(P<0.01)(见表2)。

2.7 大鼠血清TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 水平

与Sham组比较,CLP组大鼠血清中TNF-α、IL-17和IFN-γ表达均明显增高(P<0.001),与CLP组比较,CLP+EMO组的TNF-α、IL-17和IFN-γ水平显著降低(P<0.001)(见表3)。结果提示大黄素可能参与调节Th17/Treg信号轴减弱脓毒症大鼠的炎症反应。

表3 血清 TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 水平比较Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-17 and IFN-γ

2.8 大黄素对IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB信号通路相关蛋白的影响

对IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB信号通路主要示意图进行绘制(见图7)。在大黄素对上述信号通路的作用中发现,与Sham组相比,CLP组肾组织中TNF-α、IL-17A、TRAF6、NF-κBp65蛋白表达及IκBα磷酸化水平升高(P<0.05),与CLP组比较,CLP+EMO组中上述蛋白均呈现不同水平的降低(P<0.05)(见图8)。提示大黄素可能通过减少大鼠肾组织中IL-17A和TNF-α的表达减弱NF-κB信号通路的激活。

图7 IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB主要信号通路Fig.7 Main signaling pathways of IL-17/NF-κB and TNF/NF-κB

图8 大黄素对 TNF-α、IL-17A、TRAF6和NF-κB信号通路蛋白的影响Fig.8 Effect of emodin on TNF-α,IL-17A,TRAF6,and NF-κB signaling pathway 注:与Sham组比较,#P<0.05,##P<0.01,####P<0.0001;与CLP组比较,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001。Note:Compared with Sham group,#P<0.05,##P<0.01,####P<0.0001;Compared with CLP group,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001.

3 讨论与结论

研究显示,导致SA-AKI的发病因素多且复杂,涉及炎症、微循环功能障碍和代谢重编程之间的相互作用,其病理生理学涉及多种细胞类型的损伤和功能障碍。在脓毒症发病过程中,细菌释放内毒素或内毒素样物质,致使机体中性粒细胞、单核巨噬细胞、血管内皮细胞等炎性细胞激活,释放出大量的内源性炎症介质进入血液循环中,一方面造成包括肾脏在内的多器官损害,另一方面又激活更多的炎性细胞参与发病,形成恶性的免疫网络反应[7]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的SA-AKI的SD大鼠模型中,橙花叔醇通过抑制NF-κB和Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路减轻SA-AKI[8]。TLR4/NF-κB通路被证实参与肾脏炎症应答的过程,抑制TLR4/NF-κB介导的炎性反应对LPS诱导的AKI具有保护作用。可见,炎性反应是SA-AKI发病的重要机制,抑制炎性反应通路是治疗脓毒症的一种重要的治疗方案,为临床上治疗SA-AKI患者提供了新思路。

本研究借助于生物数据库分析出包含了2 801个SA-AKI发病过程的关键靶点,对靶点KEGG分析结果表明共5条关键的炎症反应信号通路,其中TNF信号通路与IL-17信号通路排名靠前,并且NF-κB信号通路作为两者的枢纽共同参与SA-AKI发病进程。在TNF信号通路中,TNF-α不仅是上游激活NF-κB信号的关键,同时又作为NF-κB信号通路的下游响应分子,提示其通过正反馈促进NF-κB信号通路,且二者相辅相成。在IL-17信号通路中,IL-17家族中IL-17A是主要的启动因子,Th17细胞是其主要分泌细胞。在CLP诱导的模型中发现IL-17A在腹腔中的高表达,且在严重脓毒症后的炎症反应中起关键作用,并且通过中和腹腔中的IL-17A则能够减少促炎性细胞因子的产生[9]。同时有研究表明树突状细胞(dendritic cell,DC)中Toll样受体9(toll like receptor 9,TLR9)介导γδT细胞产生的IL-17A可能在SA-AKI的发展中起关键作用[10];另有研究表明敲除IL-17A可预防SA-AKI[11]。上述表明TNF-α与IL-17A是脓毒症的促炎因子,且TNF信号通路与IL-17信号通路广泛参与脓毒症的发生发展过程中,与数据分析结果相吻合。

而大黄素对脓毒症的治疗也已有较多研究,主要集中于脑、血液、心肌、肠道和肺组织。在脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy,SAE),大黄素可以改善认知功能障碍和病理损伤,并且通过上调 BDNF/TrkB 信号抑制 CLP 诱导的小鼠炎症反应[12]。在血液系统中,大黄素下调P-选择素,改善脓毒症后期的血小板数量和聚集能力,同时改善内源性凝血因子活性和纤维蛋白原功能,发挥抗炎作用[13]。在脓毒症心肌病中,发现大黄素可以逆转脓毒症大鼠心功能不全并改善心肌状况,这可能与其抑制炎症小体的激活有关[14]。在脓毒症诱导肠损伤中,大黄素可以改善肠道黏膜损伤,表现为炎症因子和氧化应激标志物水平的降低,而其作用机制可能与VDR/Nrf2/HO-1通路有关[15];并通过提高紧密连接(tight junction,TJ)蛋白表达水平保护肠屏障完整性,抑制肠屏障通透性[6]。除改善肠道的炎症反应和屏障功能外,大黄素还能阻止大肠埃希菌的位移,防止细菌的扩散转移,减少细菌所引起的二次危害[16]。在脓毒症相关急性肺损伤中,大黄素可抑制NF-kB和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)通路[17],从而减轻肺部氧化应激和炎症反应。另一项关于肺部的研究是基于自噬通路所探讨的,在大黄素的干预下可以有效的阻止急性肺损伤发病进程[18]。不仅如此,另有研究表明大黄素可通过调节水通道蛋白(aquaporin,AQP)、TJ、炎症因子和肺细胞凋亡等途径有效减轻脓毒症急性肺损伤中的肺组织水肿[19]。大黄素对于SA-AKI的研究尚未报道,通过本研究发现CLP模型大鼠经过大黄素的治疗后,ELISA结果显示TNF-α、IL-17和IFN-γ表达降低,这与大黄素抑制脓毒症炎症反应结果相一致。

同样的对大黄素影响Th17/Treg炎症轴也已被阐述。在对急性胰腺炎的研究中发现,大黄素通过调节IFNγ/IL-17比例抑制严重急性胰腺炎免疫反应进而缓解肠屏障功能障碍[20]。而本研究发现在SA-AKI中,大黄素同样可以减少IL-17A的表达,并且改善其炎症反应。

综上所述,本研究通过数据挖掘,确立了大黄素发病过程的2 801个关键基因,GO生物过程分析提示这些靶点的生物学功能主要涉及膜信号转导、血管调节和伤口愈合。KEGG 通路富集分析显示,TNF、IL-17、PI3K-Akt、NF-κB和MAPK信号通路是富集与炎症相关的信号通路。实验验证大黄素治疗SA-AKI肾功能好转,且氧化应激水平(MDA)与炎性细胞因子(TNF-α、IL-17和IFN-γ)水平降低,IL-17A、TNF-α、TRAF6、NF-κBp65蛋白表达和IκBα磷酸化水平与CLP组相比明显下降,这与数据分析结果相符。提示大黄素可改善大鼠SA-AKI,可能与IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB信号通路有关。