苍术多糖与正丁醇部位对脾虚大鼠线粒体自噬的影响

徐慧颖,丁奕辉,董 昊,赵雪岑,柏 阳,才 谦

辽宁中医药大学药学院,大连 116600

脾虚属脏腑辩证中常见之证型,通常表现为消瘦、食欲不振、胃脘痛、胀气、乏力、面色萎蔫、便溏等。脾虚表明机体处于低能量代谢状态,尤其与胃肠功能障碍有关[1]。值得关注的是,线粒体是机体胃肠蠕动的重要能量来源,通过氧化磷酸化以ATP的形式产生能量,是“脾主运化”的重要环节[2]。氧化损伤、营养缺乏等外界刺激易导致线粒体损伤,对此,宿主细胞可启动自噬机制清除损伤的线粒体,维持细胞内的环境稳态[3]。如自噬功能受损不能及时清除损伤的线粒体,可诱导细胞死亡。研究发现,脾虚动物骨骼肌、神经、肝脏、心肌等细胞中均发现线粒体自噬异常[4,5]。

苍术Atractylodeslancea(Thunb.) DC为菊科多年生草本植物,具有燥湿健脾之功效。《中国药典》规定其基源为菊科植物茅苍术或北苍术的根茎[6]。茅苍术野生资源主要分布于湖北、安徽宣城、江西武宁和陕西汉中等地区,北苍术野生资源主要分布东北、内蒙、河北等地区。传统认为江苏茅山地区的苍术质量最好,为道地药材。在泰国、日本等许多国家,苍术也常用来治疗消化系统疾病。现代药理研究表明,苍术可以调节大鼠血清中胃肠激素水平[7];苍术提取物对胃癌细胞(bgc-823和sgc-7901)[8]与幽门螺杆菌的生长[9]均有抑制作用。苍术含有多种类型的化学成分,分别为挥发油、多糖、苷类和低极性非挥发物质。课题组之前研究发现,苍术多糖与正丁醇部位(苷类)对脾虚具有治疗作用[10,11],本实验是在此基础上,首次从线粒体自噬的角度对苍术有效部位调节脾虚的作用机制进行探究,旨在为苍术的合理应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物与制备

生茅苍术采自于湖北罗田中药种植基地(非道地药材),番泻叶购自海王星辰药店(生产批号:20210801),经辽宁中医药大学中药鉴定教研组许亮教授鉴定分别为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.) DC.根茎、豆科植物狭叶番泻CassiaangustifoliaVahl的干燥小叶。

1.1.1 麸炒苍术正丁醇萃取物的制备

取麸炒茅苍术(根据中国药典记载方法炮制),粉碎后过60目筛。称取一定量粉末加8倍量温水浸泡1 h,80 ℃提取3 h,提取出挥发油,提取液过滤,滤液减压浓缩作为水提液。药渣加入8倍量70%的乙醇再次提取3 h,过滤,滤液减压浓缩作为醇提液。合并上述水提液与醇提液,依次用二氯甲烷、正丁醇萃取3次,回收正丁醇溶剂得到麸炒苍术正丁醇萃取物,收率为3.2%。

1.1.2 麸炒苍术多糖的制备

将上述萃取后的剩余液加入4.2倍量的95%乙醇,静置12 h,过滤得沉淀,沉淀冷冻干燥,得麸炒苍术粗多糖,收率为20%。

1.1.3 药液的配置

根据课题组前期研究结果,苍术在0.945 mg/g剂量下对脾虚大鼠有治疗作用,本次试验选取0.945 mg/g剂量进行研究。结合收率将正丁醇萃取物加入0.5%羧甲基纤维素钠配制成0.012 g/mL的药液,折合生药量0.378 g/mL。结合收率将多糖加入蒸馏水配制成0.075 6 g/mL的药液,折合生药量0.378 g/mL。

1.1.4 番泻叶水煎液的制备

称取适量番泻叶,加10倍量水,大火烧开后再改小火煎煮30 min,过滤,滤液小火浓缩至含生药0.125 g/mL的水煎液。

1.2 主要试剂及仪器

ATP检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:A095-1-1);BCA总蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:A045-4-2);H2O2检测试剂盒(上海Beyotime 生物公司,货号:S0038);JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海 Beyotime 生物公司,货号:C2006);cDNA反转录试剂盒(德国Thermo公司,货号:#K1622);ECL化学发光检测试剂盒(武汉百仟度生物科技有限公司,货号:Ba1059);PINK1抗体(美国Affinity公司,货号:DF7742);Parkin抗体(美国CST公司,货号:2132s);p62抗体(美国CST公司,货号:23214S);LC3B抗体(美国 Abcam公司,货号:ab192890);β-actin抗体(美国Abcam公司,货号:ab227387);山羊抗兔Ⅱ抗、山羊抗小鼠Ⅱ抗(美国 KPL公司,货号分别为:074-1506、074-1806)。

HT7700型透射电子显微镜(日本hitachi公司);754紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司);SpectraMax Gemini XPS型荧光酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司);荧光定量PCR仪(上海宏石医疗器械有限公司);TGL-16型冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);L4158型扫描仪(EPSON公司)。

1.3 实验动物与分组

60只SPF级雄性SD大鼠,体质量(200±10)g,购于辽宁长生生物技术有限公司(合格证号:SCXK-辽-2021-0004)。室温:20～23 ℃,相对湿度:45%～55%,适应性饲养1周后,复制脾虚动物模型。本研究方案通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核(2019YS-DW-028-01)。

60只大鼠随机分为空白组(control group,Con)、模型组(model group,Mod)、麸炒苍术多糖组(FD)、麸炒苍术正丁醇部位组(FZ)、生苍术多糖组(SD)、生苍术正丁醇部位组(SZ)。除空白组外,均采用饮食不节、疲劳过度加苦寒泻下的复合因素法复制脾虚大鼠模型。方法如下:第1～14 d,单日灌胃猪油,剂量为:10 mL/(kg·d),给予饲料喂养;双日游泳,游至耐力极限,并喂饲甘蓝不给予饲料。第15～21 d,灌胃给予苦寒伤脾药物番泻叶的水煎液,剂量为:10 mL/(kg·d)。第22～28 d,FD、FZ、SD、SZ分别灌胃药液剂量为:10 mL/(kg·d)。给药期间,空白组和模型组给予相同体积的0.9% NaCl溶液。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 取材

末次给药24 h后,各组大鼠采取吸入式麻醉并剖开腹腔,冰上剪取胃窦组织,放入预冷的生理盐水中洗去血液,部分冰上切成约1 mm3小块,迅速投入2.5%戊二醛4 ℃固定,用于线粒体超微结构观察;部分分装后-80 ℃冻存用于其他检测。

1.4.2 线粒体超微结构观察

取戊二醛中固定的胃窦组织,磷酸盐缓冲液漂洗,1%的锇酸再固定,之后进行乙醇、丙酮梯度脱水,经浸透、包埋、超薄切片(60～80 nm)、铀铅双染色后,透射电镜下观察胃窦组织线粒体超微结构。

1.4.3 ATP水平测定

取冻存胃窦组织加入煮沸双蒸水充分匀浆,沸水浴10 min后离心取上清液待测。按照BCA蛋白测定试剂盒说明书要求,取待测样品置于96孔板,加入BCA工作液,37 ℃孵育30 min后,使用酶标仪测定A562 nm,根据标准曲线计算各样品的蛋白浓度。

按照ATP试剂盒说明书要求,设置空白管、标准管、测定管及对照管,空白管和标准管分别加入30 μL标准液,对照管和测定管分别加入30 μL待测样本,分别加入不同反应剂,反应结束后用紫外可见分光光度计测定各管OD值(636 nm)。按照如下公式计算样品的ATP浓度。

ATP浓度=

(OD测定-OD对照)/(OD标准-OD空白)×A×N/C

式中,A:标准品浓度,N:测定样本稀释倍数,C:样品蛋白浓度。

1.4.4 H2O2水平测定

取冻存胃窦组织加入H2O2检测裂解液,充分匀浆,离心取上清。吸取上清与H2O2检测试剂置于96孔板内,轻轻振荡使溶液混匀,室温放置30 min后使用酶标仪测定A560 nm,根据标准曲线计算出样品中H2O2的浓度。同时,采用BCA试剂盒测定匀浆液中的蛋白浓度,并用蛋白浓度校正H2O2浓度。蛋白浓度测定方法同“1.4.3”。

1.4.5 线粒体膜电位水平(MMP)测定

按照线粒体提取试剂盒说明书要求,取冻存胃窦组织加入Lysis Buffer,冰上研磨组织20余次得到匀浆混悬液,低速离心取上清,再高速离心取沉淀,所得的沉淀即为线粒体粗提物,加入Wash Buffer对线粒体粗提物进行洗涤,离心后取线粒体沉淀置于Store Buffer中重悬,即得到纯化的线粒体。

按照线粒体膜电位检测试剂盒说明书要求,将纯化的线粒体与JC-1缓冲液混合后使用荧光酶标仪进行检测,激发波长为485 nm,发射波长为590 nm。红色荧光和绿色荧光分别代表正常线粒体和去极化线粒体。以红色荧光/绿色荧光的比值表示MMP。

1.4.6 RT-PCR法检测PINK1、Parkin、p62、LC3 mRNA表达水平

采用Trizol法提取各组大鼠胃窦组织总RNA,使用cDNA反转录试剂盒合成RNA样品的第一链cDNA,并用PCR仪进行qRT-PCR分析采用Trizol法提取各组大鼠胃窦组织总RNA,使用cDNA反转录试剂盒合成RNA样品的第一链cDNA,并用PCR仪进行qRT-PCR分析。PCR反应体系:2(SYBR Gree qPCR Master Mix 5 μL,上、下游引物各0.2 μL,cDNA 2 μL,灭菌去离子水2.6 μL,共10 μL。PCR反应条件:预变性(95 ℃ 300 min),40次循环(95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s),溶解曲线(65～105 ℃)。

所有引物由天一辉远公司合成,结果用2-△△Ct方法进行分析,各基因引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.7 Western blot法检测PINK1、Parkin、p62、LC3蛋白表达水平

使用RIPA裂解缓冲液提取各组大鼠胃窦组织中总蛋白,并通过BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白,将蛋白转至PVDF膜,用5%脱脂牛奶在0.1% TBST中封闭1 h,洗膜,加入一抗PINK1(1∶2 500)、Parkin(1∶1 000)、LC3B(1∶2 500)、p62(1∶2 500)、β-actin(1∶6 000),4 ℃孵育过夜,加入二抗(1∶50 000)室温孵育1 h。采用ECL试剂盒检测条带,并用ImageJ分析目标条带。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 模型评价

空白组大鼠体格、活动、饮食与大便均正常;造模后各组大鼠体格消瘦,反应迟钝,大便溏泄,被毛蓬起枯槁无光泽,弓背,神态萎靡,蜷缩聚堆等,造模后的大鼠行为状态如图1所示。参考中医脾虚临床症状及相关文献对脾虚模型的评判标准,认为造模成功[12]。经麸炒多糖、麸炒正丁醇部位、生多糖、生正丁醇部位给药干预后,造模大鼠症状逐渐正常。

2.2 线粒体超微结构的变化

空白组大鼠胃窦组织线粒体形态规则完整,自噬溶酶体个别存在。模型组大鼠线粒体肿胀,形状不规则,嵴减少,未见典型自噬结构,提示脾虚导致胃窦组织线粒体损伤与自噬功能障碍。经麸炒苍术多糖、麸炒苍术正丁醇部位、生苍术多糖给药治疗后,线粒体结构损伤分别呈不同程度改善,且自噬溶酶体数量明显增加。生苍术正丁醇部位给药治疗后线粒体结构损伤未见改善,线粒体肿胀明显、膜内基质局部溶解,嵴减少、消失,自噬溶酶体少量存在(见图2)。

2.3 线粒体基本功能的变化

与空白组比较,模型组大鼠胃窦组织ATP与MMP水平明显下降(P<0.001),H2O2水平上升(P<0.001)。经麸炒苍术多糖、麸炒苍术正丁醇部位、生苍术多糖、生苍术正丁醇部位给药后均能显著逆转脾虚模型所致的ATP、MMP、H2O2水平的异常变化。其中,麸炒苍术多糖对ATP、MMP、H2O2的改善效果优于生苍术多糖(P<0.05),麸炒苍术正丁醇部位对H2O2的改善效果优于生苍术正丁醇部位(P<0.05)(见图3)。

2.4 线粒体自噬水平的变化

与空白组相比,模型组PINK1、Parkin、p62 mRNA表达显著增加(P<0.001)。蛋白结果与mRNA基本一致,模型组PINK1、Parkin、p62蛋白增加,LC3I向LC3II的转化减少,LC3II/I表达显著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,麸炒苍术多糖、麸炒苍术正丁醇部位、生苍术多糖、生苍术正丁醇部位给药后上述变化明显减轻,PINK1、Parkin、p62 mRNA与蛋白表达均下调,LC3II、LC3II/I蛋白表达升高(P<0.001,P<0.01,P<0.05),其中,麸炒后苍术多糖与正丁醇部位对以上指标的调节作用优于生品(P<0.05)(见图4)。

图4 各组大鼠胃窦组织线粒体自噬水平的变化Fig.4 Changes of mitophagy level in gastric antrum of rats in each

3 讨论与结论

脾虚的临床诊断一般是依据症状,脾虚病人常会表现食欲减退,脘腹隐痛,倦怠乏力,畏寒肢冷等症状。食欲减退在脾虚动物中表现为体重下降;脘腹隐痛会表现为弓背;倦怠无力则表现为神态萎靡和易疲劳;畏寒则会表现为扎堆蜷缩。本实验中,造模后大鼠消瘦,弓背,神态萎靡以及蜷缩聚堆,这些外观行为变化证明了所建立的脾虚大鼠模型是成功的。

线粒体自噬调控机制复杂,多种信号通路可介导不同种类的自噬过程,PINK1/Parkin通路是线粒体最常见、研究最为成熟的自噬信号通路。PINK1在健康的线粒体中通常是检测不到的,因为PINK1进入线粒体后被膜内水解酶(Parl)切割,随后被清除[13]。如图5所示,当线粒体受损时,由于内膜电位降低,PINK1进入线粒体路径被阻断,不断聚集在线粒体外膜并将parkin募集至受损线粒体[14]。Parkin是一种E3泛素蛋白连接酶,被PINK1激活后能够泛素化受损的线粒体膜蛋白,并被选择性自噬接头蛋白p62所识别[15],再与自噬体膜上的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)连接,启动自噬,最终降解受损的线粒体[16]。本研究发现,模型组PINK1和Parkin mRNA与蛋白显著增加,表明存在受损的线粒体,PINK1/Parkin通路已经激活,但可能由于自噬功能障碍,受损的线粒体未能被自噬降解。生、麸苍术多糖与正丁醇部位治疗后各组大鼠PINK1和Parkin mRNA与蛋白水平降低,表明一些受损的线粒体已被自噬降解清除。

图5 线粒体自噬机制图Fig.5 The mechanism of PINK1/Parkin-mediated mitophagy

线粒体自噬受众多自噬相关蛋白严密调控,因此某些关键蛋白的表达常用来判定自噬的强弱,其中较为关键的是LC3和p62等。未发生自噬时,大多数LC3以LC3I的形式存在于细胞质中,当自噬发生时,LC3Ⅰ会经泛素化修饰与自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺结合形成位于自噬体膜表面的LC3Ⅱ[17],因此,LC3II的出现常作为自噬发生的重要标志[18]。作为一种关键的选择性自噬适配蛋白,p62可与LC3II结合并作为选择性自噬的底物[19]。当溶酶体与自噬体处于结合阶段时,p62可作为溶酶体的供体,引导自噬体与之结合,形成自噬溶酶体,最后底物被溶酶体内的蛋白水解酶降解,p62随即被一同降解[20],自噬的发生通常伴随着p62的减少。本研究观察到,模型组LC3II蛋白表达和LC3II/I比值均显著低于空白组,表明脾虚时胃窦组织细胞内的自噬体形成受限。p62 mRNA与蛋白水平上升,提示自噬活性受到抑制。经生、麸苍术多糖与正丁醇部位给药后各组大鼠LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化增强,p62mRNA与蛋白水平下降,提示自噬水平上升。透射电镜结果与之对应,模型组大鼠线粒体结构损伤较重,未见自噬结构,表明自噬功能受损可能导致了受损线粒体的积累。给药后各组大鼠线粒体结构损伤减轻,自噬溶酶体数量增多。因此,我们认为脾虚导致大鼠胃窦组织线粒体自噬功能受损,而生、麸苍术多糖与正丁醇部位给药后促进了自噬的发生。

线粒体自噬受阻通常伴随着活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生,细胞内ROS水平升高将诱导氧化应激[21]。氧化应激攻击线粒体膜,导致膜电位降低、线粒体损伤和功能障碍[22],进而引发能量生成缺陷、ROS增多,造成恶性循环。受损和功能失调的线粒体被线粒体自噬选择性清除,有助于减少ROS的产生并防止正常细胞的氧化损伤[3]。H2O2是细胞内主要的内源性ROS,几乎可以由所有的氧化应激源产生,并且能够自由扩散进出细胞,造成氧化-抗氧化系统的失衡[23]。因此,本实验通过检测H2O2含量,间接评价ROS水平。研究结果表明,脾虚大鼠体内H2O2水平,膜电位和ATP降低,表明线粒体功能受损。而生、麸苍术多糖与正丁醇部位的治疗显著改善了线粒体功能,这可能是通过促进线粒体自噬和增加受损线粒体的清除实现的。

综上,我们推测,苍术多糖与正丁醇部位可能是通过改善胃窦组织自噬障碍,恢复线粒体功能,从而调节脾虚,且麸炒后多糖与正丁醇部位效果明显优于生品。