5-ALA 光动力-热敏醇质体的制备工艺研究*

罗国平，任婉婷，闫梦茹，孟会宁

（1.西安医学院药学院，陕西西安 710021；2.山东步长医药销售有限公司，山东菏泽 274418）

光动力疗法（PDT）是运用特定波长的光来激发光敏药物，使其发生一定的光化学反应，导致机体细胞或分子发生形态及机能的改变，从而达到的诊断或治疗作用[1]。5-氨基乙酰丙酸，又名5-氨基酮戊酸，目前市面上销售的该产品大多以盐酸盐（5-ALA）的形式存在，属于第二代光敏剂，可用于治疗痤疮、尖锐湿疣、银屑病、鲜红斑痣等皮肤疾病[2]，其作用的机理为：5-ALA 经皮给药后，能被病变细胞选择性的吸收并大量积蓄于该类细胞中，然后进一步转变为具有很强光敏活性的原卟啉IX（Pp IX），在一定波长光的激发下，产生大量的单线态氧，单线态氧可使病变细胞坏死，从而达到治疗疾病的目的。

研究发现，5-ALA 在应用时也存在一些问题，如稳定性差[3]，尤其在碱性条件下；极性较大导致皮肤渗透性不好，难以到达皮肤深层，在外用制剂方面存在一定的限制。为此，本实验将5-ALA 采用热敏醇质体进行包载，热敏醇质体是一种新型醇质体[4，5]，其作用有：（1）可将5-ALA 封闭在类脂质双分子层内的水相中，提高药物稳定性[3，6]；（2）醇质体[7]具有较好的变形性，能提高5-ALA 的透皮性能；（3）光动力-热敏醇质体由相变温度（Tm）稍高于体温的脂膜磷脂构成[8]，用波长为635nm 的红光照射患处，红光的热效应会使患处局部温度升高，当超过热敏醇质体的相变温度时，醇质体会释放出5-ALA，产生相应的治疗作用。本文主要研究5-ALA 光动力-热敏醇质体的制备工艺并进行药剂学性质评价[9]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

5-氨基乙酰丙酸盐酸盐原料药（99% 上海麦克林生化科技有限公司）；胆固醇（东巨荣生物工程有限公司）；大豆卵磷脂（药用）；无水乙醇、1,2-丙二醇，分析纯，天津永晟精细化工有限公司；KH2PO4、NaH2PO4、H3PO4，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司）；石油醚（色谱纯天津市天力化学试剂有限公司）；NaOH（AR 天津市化学试剂公司）。

DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；Agilent Tech.1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；TG-1650-WS 型台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；SB-5200DT 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BT125D 型电子天平（赛多斯科学仪器（北京）有限公司）；ZEN-3600Malvern 型马尔文激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 5-ALA 光动力-热敏醇质体的制备 采用乙醇注入-超声法[10]。精密称取大豆卵磷脂和胆固醇，置100mL 烧杯中，加一定体积无水乙醇超声溶解；另在避光条件下，将5-ALA 溶解于一定体积的PBS溶液中，在100r·min-1转速搅拌条件下用注射器缓慢匀速注入到上述乙醇溶液中，继续搅拌一定时间，超声处理（250W，40kHz）一定时间，即得。

1.2.2 热敏性评价 采用DSC 法进行热敏性评价。分别取上述制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体，离心，将沉淀真空干燥后置于铝制坩埚内，在体积分数为99.99%的N2氛围下，升温速度为1℃·min-1，于25~50℃范围内检测样品的热量变化。

1.2.3 包封率的测定 取5-ALA 光动力-热敏醇质体混悬液4mL，15000r·min-1转速高速离心15min，取上清液，用0.45μm 微孔滤膜（水系）过滤，取续滤液，采用高效液相色谱法测定5-ALA 的浓度，得到游离5-ALA 的浓度（C游），代入式（1）计算包封率（EE%）。

式中 m总：加入药物的总质量，mg；V总：未包封的5-ALA 质量，mg。

1.2.4 HPLC 法测定5-ALA 的含量[11]色谱条件：Agilent 5 TC-C18型色谱柱（250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈∶1.36% KH2PO4溶液（用H3PO4调pH 值至2.0）=3∶97；柱温：25℃；波长：265nm；流速：1mL·min-1；进样体积：20μL。

1.2.5 变形性测定[13]取4mL 5-ALA 光动力-热敏醇质体混悬液和4mL 水，分别测定在0.8kg 重物的压力下通过0.45μm 微孔滤膜的性能，按式（2）计算变形性（D）。

式中 V醇质体∶光动力-热敏醇质体的通过速度，mL·min-1，；V水：水的通过速度，mL·min-1。

1.2.6 平均粒径和粒度分布的测定 取制备好的5-ALA 光动力-热敏醇质体，采用Malvern 激光粒度仪进行检测。

1.2.7 单因素实验[13]

1.2.7.1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）对相变温度（Tm）和包封率的影响 按照“1.2.1”项下的制备方法加入10mg 5-ALA，乙醇10mL，pH 值为7.4 的PBS 溶液12mL，搅拌20min，超声2min。考察m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）分别为6∶1、9∶1、12∶1 时，制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体的Tm和包封率的变化情况。

1.2.7.2 不同m（囊材）∶m（药物）对包封率的影响 按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂240mg，胆固醇40mg，乙醇10mL，pH 值为7.4 的PBS 溶液12mL，搅拌20min，超声2min。考察囊材与药物质量比分别为35∶1、28∶1、21∶1 时，制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体的包封率的变化情况。

1.2.7.3 溶液pH 值对包封率的影响 按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂240mg，胆固醇40mg，5-ALA 10mg，乙醇10mL，PBS 溶液12mL，搅拌20min，超声2min。采用pH 梯度法，即在形成醇质体前，PBS 溶液的pH 值为3.0，注入法制备醇质体后，调节溶液的pH 值，考察pH 值分别为3.0、7.4、10.0 时，制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体的包封率的变化情况。

1.2.7.4 搅拌时间对包封率的影响 按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂240mg，胆固醇40mg，5-ALA 10mg，乙醇10mL，PBS 溶液12mL，超声2min。考察搅拌时间分别为10、20、30min 时，制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体的包封率的变化情况。

1.2.7.5 乙醇体积对变形性的影响 按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂240mg，胆固醇40mg，5-ALA 10mg，pH 值为7.4 的PBS 溶液12mL，搅拌20min，超声2min。考察乙醇体积分别为6、10、14mL 时，制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体的变形性变化情况。

1.2.7.6 超声时间对粒径分布系数（PDI）的影响按照“1.2.1”项下的制备方法加入大豆卵磷脂240mg，胆固醇40mg，5-ALA 10mg，无水乙醇10mL，pH 为7.4的PBS 溶液12mL，搅拌20min，考察超声时间分别为1、2、4、10min 时，制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体平均粒径和粒度分布的变化情况。

1.2.8 正交实验筛选最优制备条件[14]在单因素实验基础上，采用正交实验法，以包封率为评价指标，选择m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）（A）、m（囊材）∶m（药物）（B）和搅拌时间（C）3 个因素，每个因素设置3 个水平进行正交实验，因素水平见表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and their levels

1.2.9 药剂学性质评价 按照优选出的条件制备5-ALA 光动力-热敏醇质体，分别采用“1.2.3”项下方法测定包封率，采用“1.2.5”项下方法测定变形性，采用“1.2.6”项下方法测定平均粒径和粒度分布。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）对相变温度（Tm）和包封率的影响（图1、图2）

图1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）制备的醇质体DSC 图Fig.1 DSC diagram of glycosome prepared with different mass ratios of soybean lecithin and cholestero

图2 不同m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）对包封率的影响Fig.2 Effect of different proportions of soybean lecithin and cholesterol on encapsulation efficiency

由图1 可见，m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）=12∶1 时，Tm值约为40℃；m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）=9∶1 时，Tm值约为41℃；m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）=6∶1 时，Tm值约为42.5℃。可见，Tm值随着囊材中胆固醇的比例增加略有升高。另外，从图的形状可看出，大豆卵磷脂与胆固醇质量比为6∶1 时，相变特性最为明显。

由图2 可见，随着大豆卵磷脂与胆固醇质量比增大，包封率呈现先增大后减小的趋势，但差异不大。

2.1.2 不同m（囊材）∶m（药物）对包封率的影响（图3）

图3 囊材与药物质量比对包封率的影响Fig.3 Effect of different quality ratios of capsule materials and drugs on encapsulation efficiency

由图3 可见，包封率随着m（囊材）∶m（药物）的增大呈先增后降的趋势，但差异较小。

2.1.3 溶液pH 值对包封率的影响（图4）

图4 pH 值对包封率的影响Fig.4 Effect of pH value on encapsulation efficiency

由图4 可见，包封率随溶液pH 值的增大而增大，但pH 值为7.4 和10 时的包封率相差不大。分析原因是，采用pH 梯度法制备醇质体时，醇质体形成之前用HCl 调节水溶液的pH 值偏酸性至5-ALA盐酸盐等电点以下，采用注入法形成醇质体后，再调节溶液pH 值至5-ALA 盐酸盐等电点以上，结果醇质体内水相中药物主要以解离型存在，而外水相则主要以非解离型存在，由于醇质体膜属于脂质双分子层结构，外水相的非解离型药物可通过被动扩散从膜外进入膜内，进入膜内的药物受pH 值的影响转变为解离型；而膜内的解离型药物无法通过膜向外扩散，因此，醇质体中药物的包封率就会增大。可见，pH 梯度法可显著提高药物的包封率。考虑到皮肤用药的刺激性问题，选取溶液pH 值为7.4。

2.1.4 搅拌时间对包封率的影响（图5）

图5 搅拌时间对包封率的影响Fig.5 Effect of mixing time on encapsulation efficiency

由图5 可见，随着溶液搅拌时间的增加，包封率持续增大，但趋势逐渐减弱。

2.1.5 乙醇体积对变形性的影响（图6）

图6 乙醇体积对变形性的影响Fig.6 Effect of ethanol volume on deformability

由图6 可见，随着乙醇体积的增大，药物的变形性逐渐增大，但趋势逐渐减弱，因此，选择乙醇体积为10mL。

2.1.6 超声时间对粒径分布系数（PDI）的影响（图7）

图7 超声时间对粒径分布系数（PDI）的影响Fig.7 Effect of ultrasound time on PDI

由图7 可见，随着超声时间的延长，PDI 持续减小，即醇质体的粒径随超声时间延长变得更为均匀，但4min 后减小的趋势显著变缓，故选择超声时间为4min。

2.2 正交实验筛选最优制备条件[10]

正交实验结果和直观分析见表2，方差分析见表3。

表2 正交实验结果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the analysis of variance

由表2 可见，因素影响由大到小依次为：A>C>B，即m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）>搅拌时间>m（囊材）∶m（药物）；筛选出的最佳搭配为A2B3C3，即m（大豆卵磷脂）∶m（胆固醇）=9∶1，m（囊材）∶m（药物）=23.3∶1，搅拌时间为30min。

2.3 最优工艺条件制备的5-ALA 光动力-热敏醇质体的药剂学性质评价

2.3.1 包封率的测定 测得包封率为69.73%，包封率较高。

2.3.2 变形性的测定 测得变形性为19.15%，变形性较好。

2.3.3 粒度分布的测定（图8）

图8 5-ALA 光动力-热敏醇质体的粒径分布Fig.8 Particle size distribution of 5-ALA photodynamic-thermosensitive electrosol bodies

由图8 可见，PDI 测得为0.280，平均粒径为325.4nm，表明醇质体的粒径在纳米级别且粒度分布均匀。

3 结论

本文以大豆卵磷脂和胆固醇为囊材，无水乙醇为柔软剂，采用乙醇注入-pH 梯度法制备的5-ALA光动力-热敏醇质体药物的包封率高，具有较好的热敏性和变形性，粒径分布均匀。